Page 53 - 《中国药房》2022年6期

2.1.2 内标溶液 精密称取吲达帕胺对照品适量，用甲 酸溶液为流动相 B 进行梯度洗脱（洗脱程序见表 2）；流
醇稀释并定容，配制成质量浓度为1 mg/mL的内标贮备 速为0.2 mL/min；柱温为35 ℃；样品室温度为4 ℃；运行
液，于4 ℃下保存，备用。临用前，精密量取内标贮备液 时间为10 min；进样量为5 μL。
适量，用甲醇稀释成质量浓度为25 ng/mL的内标溶液。
表2 UPLC流动相梯度洗脱程序
2.2 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸再生系统溶液
时间/min 甲醇/％ 0.05％甲酸溶液/％
的配制 0 25 75
称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠、葡萄糖-6-磷 0.5 25 75
酸-二钠、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶各适量，分别用水溶解， 5 95 5
7 95 5
分装并于－80 ℃下保存。使用时，取三者混合，配制成 7.1 25 75
含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠 7.5 mmol/L、葡萄 10 25 75
糖-6-磷酸-二钠75 mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶15 U/mL
2.5.2 质谱条件 离子源为电喷雾电离源，离子源温度
的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸再生系统溶液（后
为 150 ℃ ；毛 细 管 电 压 为 0.5 kV；脱 溶 剂 气 温 度 为
文简称“再生系统溶液”）。
350 ℃；锥孔气流量为 1 L/h；脱溶剂气流量（氮气）为
2.3 探针底物溶液、代谢产物溶液及阳性抑制剂溶液的 650 L/h；碰撞气为氩气（纯度大于 99.999％）；扫描模式
配制
为多反应监测模式，扫描方式为正离子扫描；数据采集
精密称取 CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、
范围为m/z 10～1 000，数据采集及处理软件为MassLynx
CYP2D6、CYP3A4的探针底物（非那西丁、美芬妥因、双
V4.1 工作站，通过调谐优化质谱参数，最终确定 6 种探
氯芬酸、香豆素、右美沙芬、睾酮）、代谢产物（对乙酰氨
针底物的代谢产物和内标的质谱条件如表3所示。
基酚、4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、7-羟基香豆素、
右啡烷、6β-羟基睾酮）和阳性抑制剂（α-萘黄酮、噻氯匹 表3 6种探针底物的代谢产物和内标的质谱条件
定、磺胺苯吡唑、毛果芸香碱、奎尼丁、酮康唑）对照品各 代谢产物/内标 探针底物 前体离子m/z 产物离子m/z 锥孔电压/V 碰撞电压/eV
对乙酰氨基酚 非那西丁 152 110 39 14
适量，用甲醇稀释并定容，配制成质量浓度均为1 mg/mL
4-羟基美芬妥因 美芬妥因 235 150 33 17
的贮备液，于4 ℃下保存，备用。临用前，精密量取上述 4-羟基双氯芬酸 双氯芬酸 312 231 25 20
单一贮备液，用甲醇稀释成浓度分别均为 0.1、2.5、1、1、 7-羟基香豆素 香豆素 163 107 40 20
2、1 mmol/L的溶液，备用。 右啡烷 右美沙芬 258 157 40 40
6β-羟基睾酮 睾酮 305 269 39 15
2.4 肝微粒体孵育体系的建立
吲达帕胺（内标） 366 132 34 15
肝微粒体孵育体系终体积为200 μL，体系中包含再
2.5.3 专属性考察 取空白肝微粒体，除不加探针底
生系统溶液 60 μL、4 mmol/L 氯化镁 20 μL、肝微粒体 20
物、毛蕊花糖苷、内标外，其余按“2.4”项下方法处理，按
μL、探针底物 20 μL、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4，下
同）100 μL，其中甲醇含量不超过 1％。配制方法如下： “2.5.1”“2.5.2”项下色谱与质谱条件进样测定，记录色谱
将磷酸盐缓冲液、肝微粒体、探针底物溶液、毛蕊花糖苷 图（图略）；将“2.3”项下代谢产物溶液和“2.1.2”项下内标
溶液或阳性抑制剂溶液混匀，于 37 ℃水浴中预孵育 5 溶液加至灭活的空白肝微粒体中，离心后同法进样测
min，加入再生系统溶液启动反应，再于 37 ℃水浴中孵 定，记录色谱图（图2A）；按“2.4”项下方法制备肝微粒体
育相应时间（表1）后取样。向取出的孵育液中加入冰甲 孵育液，同法进样测定，记录色谱图（图2B）。结果显示，
醇（终止反应）和内标溶液各100 μL，于4 ℃下以12 000 代谢产物对乙酰氨基酚、4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬
r/min离心10 min，取上清液。将上述6种上清液等体积 酸、7-羟基香豆素、右啡烷、6β-羟基睾酮和内标的保留时
涡旋混合，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清 间分别约为 1.0、5.5、4.4、2.4、2.2、5.2、3.4 min，各色谱峰
液，进样测定。每个样本平行操作3次。 峰形和分离度均良好，表明本方法专属性良好。
表1 6种探针底物肝微粒体孵育体系的反应条件 2.5.4 线性关系与定量下限考察 分别吸取对乙酰氨
基酚、4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、7-羟基香豆素、
探针底物 CYP酶 肝微粒体蛋白质量浓度/（mg/mL） 孵育时间/min
非那西丁 CYP1A2 0.5 20 右啡烷、6β-羟基睾酮单一贮备液适量，用甲醇稀释，配
美芬妥因 CYP2C19 0.5 20 制成对乙酰氨基酚浓度分别为 0.26、0.52、1.04、2.09、
双氯芬酸 CYP2C9 0.5 60
香豆素 CYP2A6 0.5 60 4.18、8.35 μmol/L，4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、7-
右美沙芬 CYP2D6 0.5 10 羟基香豆素、右啡烷浓度分别均为0.36、1.44、4.32、8.64、
睾酮 CYP3A4 0.5 10
17.28、34.56 μmol/L，6β-羟基睾酮浓度分别为1.72、6.91、
2.5 分析方法的建立 4.32、20.76、82.94、165.89 μmol/L 的对照品溶液。将上
2.5.1 色谱条件 以Acquity UPLCⅢ BEH C18 （50 mm× 述 6 种代谢产物对照品溶液加至灭活的空白肝微粒体
2.1 mm，1.7 μm）为色谱柱，以甲醇为流动相 A、0.5％甲 中，制成不同浓度的系列工作溶液，按“2.4”项下方法处

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