Page 56 - 《中国药房》2022年6期
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溶液，阳性抑制剂组孵育体系中分别加入α-萘黄酮、噻                           CYP酶抑制剂强度分级规则——IC50小于1 μmol/L为强
        氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果芸香碱、奎尼丁、酮康唑的磷                           抑制剂，IC50介于1～＜10 μmol/L为中等强度抑制剂，IC50
        酸钾缓冲液使各个阳性抑制剂的终浓度分别为 25、20、                         介 于 10～50 μ mol/L 为 弱 抑 制 剂 ，毛 蕊 花 糖 苷 是
                                                                                           [19]
        10、10、10、1 μmol/L，空白对照组孵育体系中用等体积的                   CYP3A4 的中等强度抑制剂，对其他 CYP 酶的抑制作
        磷酸钾缓冲液代替药物，各组孵育体系中探针底物非那                            用弱。
        西丁、美芬妥因、双氯芬酸、香豆素、右美沙芬、睾酮的浓                          2.7 分子对接
        度分别为 150、25、30、10、10、50 μmol/L 。孵育相应时                   为了更好地理解毛蕊花糖苷与 CYP 酶之间的相互
                                          [17]
        间后取样，按“2.4”项下方法处理，再按“2.5.1”“2.5.2”项                 作用，采用分子对接法进行解释。CYP酶的蛋白结构从
        下色谱与质谱条件进样测定，计算各探针底物对应代谢                            PDB 蛋白数据库（http：//www.rcsb.org/）下载；生成 X、Y、
        产物对乙酰氨基酚、4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、                         Z坐标尺寸为50×50×50的网格框，网格点间距为0.375 Å
        7-羟基香豆素、右啡烷、6β-羟基睾酮的含量。以空白对                        （1 Å=1×10  －10  m）。使用 AutoDock Vina 1.1.2 软件分别
        照组中代谢产物的含量为 100％，以其余各组代谢产物                          将毛蕊花糖苷和阳性抑制剂的小分子连接到 CYP 酶的
        的含量与空白对照组的百分比计算剩余酶活性（％）。                            刚性蛋白中，采用拉马克学习遗传算法（Lamarckian ge-
        以药物浓度的对数值为横坐标、剩余酶活性为纵坐标，                            netic algorithm，LGA）计算毛蕊花糖苷和阳性抑制剂与
        采用 GraphPad v8.0 软件进行非线性拟合并计算半数抑                    CYP酶之间的分子对接活性域。根据对接结果，可以得
        制浓度（median inhibitory concentration，IC50 ）。         到若干个对接结构，根据最低对接能量选择最优构象。
        2.6.2  阳性抑制剂的酶抑制作用              阳性抑制剂α-萘黄           利用Discovery Studio 2019软件打开CYP酶蛋白结构和
        酮、噻氯匹定、磺胺苯吡唑、毛果芸香碱、奎尼丁、酮康唑                          对接结果，分析毛蕊花糖苷和阳性抑制剂与CYP酶之间
        对 大 鼠 肝 微 粒 体 中 CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、              的结合靶点和作用方式，同时计算两个复合物的结合自
        CYP2A6、CYP2D6、CYP3A4 的 IC50 分 别 为 2.16、1.19、        由能并进行比较，以判断亲和力的强弱。根据“2.6.3”项
                                            [18]
        0.75、3.34、0.16、0.06 μmol/L，与相关文献 结果基本一              下结果，选择 CYP3A4 酶分别与毛蕊花糖苷、阳性抑制
        致，证明了本方法具有可行性。                                      剂酮康唑进行分子对接。结果显示，毛蕊花糖苷与
        2.6.3  毛蕊花糖苷的酶抑制作用             毛蕊花糖苷对大鼠             CYP3A4 酶的相互作用（图 4A）主要是通过氢键以及疏
        肝 微 粒 体 中 CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2A6、             水作用力来介导的，包括该化合物分别与 GLN-79、
        CYP2D6、CYP3A4酶的抑制曲线见图3。毛蕊花糖苷对                       LYS-390 形成氢键，与 GLN-79、PRO-107 形成 C—H 键，
        大鼠肝微粒体中CYP1A2、CYP2A6酶的IC50＞30 μmol/L                与 PRO-227、LYS-378 具有π-烷基相互作用；酮康唑与
        （本研究将毛蕊花糖苷的最高浓度设定为 30 μmol/L，                       CYP3A4 酶的相互作用（图 4B）主要是通过氢键以及静
        IC50超过 30 μmol/L 则认为无抑制作用），对大鼠肝微粒                   电相互作用来介导的，包括该化合物分别与 ALA-370、
        体中 CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4 酶的 IC50分            ARG-372、PRO-107 形成 C—H 键，与 LEU-373 具有π-烷
        别为 24.87、21.52、12.56、7.55 μmol/L。参考国际通用的            基相互作用，与 PHE-213、PHE-304 具有烷基相互作用，

           105                               90                               100
                                                                               90
           100
           剩余酶活性/％  95                      剩余酶活性/％  80                      剩余酶活性/％  80

                                             70
            90
                                                                               70
            85                               60                                60
             －3    －2    －1     0      1       －3    －2    －1     0     1       －3    －2    －1     0     1
                   毛蕊花糖苷浓度的对数值                      毛蕊花糖苷浓度的对数值                      毛蕊花糖苷浓度的对数值
                       A. CYP1A2                        B. CYP2C19                        C. CYP2C9
            75                               75                               90
            70                               70                               80
           剩余酶活性/％  65                      剩余酶活性/％  65                       剩余酶活性/％  70

            60
            55                               60                               60
            50                               55                               50
             －3    －2    －1     0     1       －3     －2    －1     0     1       －3    －2    －1     0     1
                  毛蕊花糖苷浓度的对数值                       毛蕊花糖苷浓度的对数值                      毛蕊花糖苷浓度的对数值
                       D. CYP2A6                        E. CYP2D6                         F. CYP3A4
                             图3 毛蕊花糖苷对大鼠肝微粒体中6种CYP酶的抑制曲线（n＝3）


        ·690 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 6                                    中国药房    2022年第33卷第6期
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