Page 93 - 《中国药房》2022年5期
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2.2 Aβ42溶液的制备                                      2.7 PC12 细胞中 cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白
            将1 mg Aβ 42溶解于221.5 μL去离子水中，制成浓度               表达水平检测
        为 1 000 μmol/L 的溶液，然后置于 37 ℃、5％CO2培养箱                  采用Western blot法进行检测。取对数生长期PC12
        中培养24 h，以制备Aβ42寡聚体 ，于－20 ℃保存，备用。                   细胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复
                                  [9]
        2.3 分组                                             孔。于细胞培养结束后，收集细胞，提取细胞总蛋白；采
            根据本课题组前期 MTT 实验发现，Aβ 42诱导 PC12                 用BCA法测定总蛋白含量，并制备蛋白样品。将蛋白样
        细胞损伤的最适浓度为2 μmol/L，芥子酸的最适给药浓                       品加至聚丙烯酰胺凝胶中，以恒压（电压 110 V）电泳进
        度为100 μmol/L  [8－9] 。根据文献[11－12]报道，处理PC12          行分离，再以恒压（电压75 V，2 h）进行转膜，以5％BSA
        细胞时，PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126的                   封闭液封闭 1 h，加入 cAMP、PKA、CREB、p-CREB 一抗
        最适给药浓度为均为10 μmol/L。本研究分组如下：对照                      （稀释度均为1 ∶ 800）及β-actin一抗（稀释度为1 ∶ 1 000），
        组、模型组（Aβ 42 2 μmol/L）、芥子酸组（Aβ 42 2 μmol/L+芥        于4 ℃过夜；以TBST溶液清洗3次，每次 5 min，加入二
        子酸 100 μmol/L）、PI3K 抑制剂组（Aβ 42 2 μmol/L+芥子         抗（稀释度为 1 ∶ 1 000），于 37 ℃条件下反应 1 h；以
        酸 100 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、ERK 抑制剂组          TBST 溶液清洗 3 次，每次 5 min，以 ECL 显色后，采用
       （Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L+U0126 10 μmol/L）。      凝胶成像系统曝光成像。采用 Image Lab 4.0.1 图像分
        2.4 PC12细胞存活率检测及形态观察                               析软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值
            采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期 PC12 细                   表示目的蛋白表达水平（以对照组为“1”计算其余组相
                              5
                                  －1
        胞，调整细胞密度为 1×10 mL ，接种于 6 孔板中，每孔                    对值）。实验重复3次。
        1.5 mL，按“2.3”项下方法分组，另设仅加入细胞培养基                     2.8 统计学方法
        的空白组，每组设置 8 个复孔。培养 24 h 后，PI3K 抑制                      采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，数据以
        剂组、ERK 抑制剂组先加入 LY294002、U0126 培养 1 h；              x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
        然后除对照组外，其余 4 组分别加入 2 μmol/L Aβ 42继续                比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        培养24 h以造模；除对照组及模型组外，其余3组再分别                        3 结果
        加入100 μmol/L 芥子酸继续培养24 h后，置于倒置显微                   3.1  芥子酸对PC12细胞存活率及形态的影响
        镜下观察并拍照；随后加入10 μL CCK-8试剂，继续培养                         与对照组比较，模型组 PC12 细胞存活率显著降低
        4 h，采用酶标仪于 450 nm波长下检测各孔吸光度（OD）                    （P＜0.05）；与模型组比较，芥子酸组 PC12 细胞存活率
        值，并计算细胞存活率[细胞存活率＝（实验组 OD 值－                        显著升高（P＜0.05）；与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和
        空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100％]。                     ERK 抑 制 剂 组 PC12 细 胞 存 活 率 均 显 著 降 低（P＜
        2.5  PC12细胞中Aβ42含量检测                               0.05）。结果见表2。
            采用 ELISA 法进行检测。取对数生长期 PC12 细                   表 2   各组 PC12 细胞存活率的检测结果（x±±s，n＝
        胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复                            8，％％）
        孔。于细胞培养结束后，弃原培养基，以PBS清洗细胞1                          组别           细胞存活率      组别              细胞存活率
        遍，用胰酶消化后，加入培养基终止消化，以1 000 r/min                     对照组          100.00±2.30  PI3K抑制剂组     83.48±6.32 c
                                                            模型组          80.74±3.79 a  ERK抑制剂组     81.70±5.54 c
        离心 5 min，收集细胞；以 PBS 清洗 3 遍后，重悬细胞，采
                                                            芥子酸组         92.97±3.19 b
        用超声法裂解细胞，以 5 000 r/min 离心 15 min，取上清                   a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与芥子酸
        液，按照ELISA试剂盒说明书方法操作，测定PC12细胞                       组比较，P＜0.05
        中Aβ42的含量。                                              经显微镜观察后发现，对照组细胞贴壁良好，饱满
        2.6 PC12细胞中CREB mRNA表达水平检测                         且边缘清晰，可见长短不一的突触，细胞间连接紧密。
            采用 PCR 法进行检测。取对数生长期 PC12 细胞，                   模型组细胞数量较对照组明显减少，且细胞形态趋于圆
        按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复孔。                      形，突触变短、变少，并伴有大量碎片。芥子酸组细胞形
        于细胞培养结束后，按 RNAiso Plus 试剂盒说明书方法                    态明显改善，突触增多，且与对照组形态相似。而与芥
        操作提取各组细胞的总 RNA，逆转录合成 cDNA 模板，                      子酸组比较，PI3K 抑制剂组和 ERK 抑制剂组细胞形态
        再进行 PCR 反应。PCR 反应体系包括 cDNA 10 μL、                  不规则，碎片增多，且突触连接减少。结果见图1。
                 RT
        PrimeScript Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、  3.2 芥子酸对PC12细胞中Aβ42含量的影响
        5×PrimeScript Buffer 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL。PCR     与对照组比较，模型组 PC12 细胞中 Aβ 42含量显著
        反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 °C退火                升高（P＜0.05）；与模型组比较，芥子酸组 PC12 细胞中
        延伸 34 s，共 40 个循环。反应结束后，采用 2             －ΔΔCt 法计   Aβ 42含量显著降低（P＜0.05）；与芥子酸组比较，PI3K抑
        算目的基因的表达水平（以对照组为“1”计算其余组相                          制剂组和ERK抑制剂组PC12细胞中Aβ42含量均显著升
        对值）。实验重复 3 次。                                      高（P＜0.05）。结果见表3。


        中国药房    2022年第33卷第5期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5  ·599 ·
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