Page 92 - 《中国药房》2022年5期
P. 92

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是与年龄              M200 PRO型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），5804R型
        高度相关的中枢神经系统退行性疾病，该疾病的症状始                            离心机（德国 Eppendorf 公司），S11-6-S 型恒温水浴锅
        于轻度的记忆困难，并逐渐发展为认知障碍和日常活动                           （上海跃进医疗器械有限公司），LDZH-200KBS 型高压
        功能障碍，现已成为严重威胁人类生命健康的重大疾病                            蒸汽灭菌器（上海申安自动化系统工程公司），C1000
        之一 。AD 的神经病理学特征包括一些异常蛋白的积                           Touch 型基因扩增仪、165-8001 型电泳仪、1703811 型电
            [1]
        累，如淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein）的分             转仪、Gel Doc XR型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
        裂导致β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成老               1.2 主要药品与试剂
        年斑，使得突触丢失，造成神经退行性病变                  [2－3] ，其中Aβ40      本研究所用主要药品与试剂有芥子酸对照品（上海
        在 AD 的发病机制具有保护作用，而 Aβ 42 具有致病作
                                                            源叶生物科技有限公司，纯度≥97％，批号S30697）；Aβ 42
          [4]
        用 。因此，抑制Aβ42的神经毒性已成为现代AD领域研                        （北京博奥森生物技术有限公司，批号 bs-0107p）；胎牛
        究热点，找到能够抑制Aβ 42神经毒性的药物对有效预防                         血清（美国BI公司，批号04-007-1A）；RPMI 1640培养基
        和治疗AD具有重要意义。                                       （美国HyClone公司，批号SH30809.01）；胰蛋白酶、青链
            芥子酸及其衍生物 canolol、芥子碱、丁香醛等对                      霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为
        AD、帕金森病、共济失调、重症肌无力等均有一定的治                           TB150、P1400）；LY294002 对照品（纯度 100％）、U0126
               [5]
        疗功效 。本课题组前期研究发现，大鼠灌胃中药远志                            对照品（纯度100％）、CCK-8试剂盒（美国AbMole公司，
        后，在其脑脊液成分中检测出芥子酸；灌胃开心散后，在
                                                            批号分别为15447-36-6、109511-58-2、M4839）；大鼠Aβ42
        其血液中检测出远志糖酯类化合物 tenuifoliside A，该化
                                                            酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海蓝基生物科技
        合物与芥子酸存在相似的基本母核，并可以提高大鼠海
                                                            有限公司，批号 E02A0050）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、
        马神经元的存活率。相关研究发现，芥子酸对 Aβ 1-42诱
                                                            ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，
        导的 PC12 细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与
                                                            批号分别为 ST036、P0018AS）；兔源 PKA 多克隆抗体
        激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B/糖原合成激酶 3β
                                                           （武汉三鹰生物技术有限公司，批号 24503-1-AP）；兔源
        （phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B/glycogen syn-
                                                            cAMP 多克隆抗体（美国Abcam公司，批号ab76238）；兔
        thase kinase 3β，PI3K/Akt/GSK3β）和脑源性神经营养因
                                                            源CREB多克隆抗体、兔源磷酸化CREB（p-CREB）多克
        子/酪 氨 酸 激 酶 B/细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶（brain-
                                                            隆抗体（美国CST公司，批号分别为9197、9198）；鼠源β-
        derived neurotrophic factor/tyrosine kinase B/extracellular
                                                            肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）
        signal-regulated kinase，BDNF/TrkB/ERK）等信号通路有
                                                            标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗、HRP 标记的
        关 [6－9] 。这提示芥子酸在治疗神经退行性疾病方面具有
                                                            山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，
        一定作用。另有相关研究发现，PI3K/Akt/GSK3β和
                                                            批号分别为151218、122826、122011）。PCR引物由生工
        BDNF/TrkB/ERK信号通路下游的环磷酸腺苷/蛋白激酶
                                                            生物工程（上海）有限公司设计、合成（具体引物序列及
        A/cAMP 反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophos-
                                                            扩增产物长度见表1）。其余试剂为实验室常用规格，水
        phate/protein kinase A/cAMP response element binding
                                                            为去离子水。
        protein，cAMP/PKA/CREB）信号通路也是大脑内重要的
                                                                    表1 PCR引物序列及扩增产物长度
        信号通路之一，对神经元的存活与分化、突触的形成等
        均具有重要作用 。                                           基因           引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
                      [10]
                                                            CREB     上游引物：TGGAGCCGAGAACCAGCAGAG       83
            在本课题组前期研究的基础上，本研究以具有神经                                   下游引物：GAGTTACGGTGGGAGCAGATGATG
        细胞特性的 PC12 细胞作为研究对象，用 Aβ 42 诱导该细                    β-actin  上游引物：CAATGAGCGGTTCCGTTGCC        128
        胞损伤以制备AD的体外模型，然后研究芥子酸对Aβ 42诱                                 下游引物：CCAGACAGCACTGTGTTGGC
        导 PC12 细 胞 损 伤 的 改 善 作 用 ，并 基 于 cAMP/PKA/           1.3 细胞
        CREB信号通路探讨其作用机制，以期为芥子酸防治AD                              大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞（高分化）由
        提供实验依据。                                             中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。
        1 材料                                                2 方法
        1.1 主要仪器                                            2.1 PC12细胞的培养
            本研究所用主要仪器有 Series 8000 型 CO2培养箱、                    将 PC12 细胞置于含 10％胎牛血清、100 U/mL 青霉
        QuantStudio 5 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美                  素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养基（以下简称
        国 Thermo Fisher Scientific 公司），DL-CJ-2NDII 型超净     “培养基”）中，于5％CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培
        工 作 台（哈 尔 滨 市 东 联 电 子 技 术 开 发 有 限 公 司），             养，每 2～3 d 换液 1 次，待细胞呈单层贴壁状并进入对
        CKX41-A32PH 型倒置显微镜（日本 Olympus 公司），                  数生长期时，用于后续实验。


        ·598 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5                                    中国药房    2022年第33卷第5期
   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97