Page 38 - 《中国药房》2022年5期
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H9c2心肌细胞培养液，以3 000 r/min离心5 min，收集上                 3 结果
        清液，检测 LDH 释放量；另将 RIPA 裂解液加入各组                       3.1  类叶升麻苷对 H/R 诱导 H9c2 心肌细胞凋亡及
        H9c2心肌细胞中进行细胞裂解，检测MDA水平和SOD                         Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的影响
        活性。严格按照试剂盒说明书进行操作。                                      与对照组比较，H/R 组 H9c2 心肌细胞的凋亡率和
        2.4 TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测                            Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平显
            采用酶联免疫吸附试验法检测。收集各组造模、给                          著升高（P＜0.05）；与 H/R 组比较，H/R+AS-L 组、H/R+
        药后的H9c2心肌细胞培养液，以3 000 r/min离心5 min，                 AS-M 组 、H/R + AS-H 组 H9c2 心 肌 细 胞 的 凋 亡 率 和
        收集上清液，检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。严格按照试                    Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平显
        剂盒说明书进行操作。                                          著降低（P＜0.05），表明成功建立心肌缺血再灌注损伤
        2.5 Rnd3、NF-κB p65 mRNA表达水平检测                       模型；与H/R+AS-L组比较，H/R+AS-M组、H/R+AS-H组
            采用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪检测。取各                    H9c2 心肌细胞的凋亡率和 Cleaved Caspase-3、Cleaved
        组造模、给药后的H9c2心肌细胞，加入1 mL Trizol试剂                    Caspase-9蛋白表达水平降低更显著（P＜0.05）；与H/R+
        提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再以GAPDH作为                        AS-M 组比较，H/R+AS-H 组 H9c2 心肌细胞的凋亡率和
        内参，进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系：10×PCR                        Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平降
        缓冲液2.5 μL，MgSO4 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物           低更显著（P＜0.05）。结果见表2、图1。
        各 0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O 补足体系至           表 2   类叶升麻苷对 H/R 诱导 H9c2 心肌细胞凋亡及
        25 μL。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，               Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达
        72 ℃ 30 s，循环 40 次。采用 Quantity One 软件进行分                   的影响（x±±s，n＝9）
        析，以目的基因条带与内参基因条带的比值表示Rnd3、                          组别          细胞凋亡率/％    Cleaved Caspase-3蛋白  Cleaved Caspase-9蛋白
                                                            对照组         5.99±0.73    0.27±0.04    0.29±0.04
        NF-κB p65 mRNA 表达水平。PCR 引物序列和产物长
                                                            H/R组        27.99±4.35 a  0.90±0.03 a  0.92±0.03 a
        度见表1。                                               H/R+AS-L组   18.88±0.99 b  0.69±0.04 b  0.76±0.04 b
                  表1 PCR引物序列和产物长度                           H/R+AS-M组   15.17±0.82 bc  0.53±0.03 bc  0.60±0.05 bc
                                                            H/R+AS-H组   12.06±1.08 bcd  0.41±0.03 bcd  0.44±0.03 bcd
         基因                引物序列                 产物长度，bp
         Rnd3       上游：5′-CTATGACCAGGGGGCAAATA-3′  89       F P          135.593      457.627      374.520
                                                                         ＜0.05
                                                                                      ＜0.05
                                                                                                   ＜0.05
                    下游：5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′
         NF-κB p65  上游：5′-ATTCTGACCTTGCCTATCTAC-3′  68         a：与对照组比较，P＜0.05；b：与 H/R 组比较，P＜0.05；c：与 H/R+
                    下游：5′-AAATCCTTCCCAAACTCC-3′             AS-L组比较，P＜0.05；d：与H/R+AS-M组比较，P＜0.05
         GAPDH      上游：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′  494       3.2  类叶升麻苷对H/R诱导H9c2心肌细胞炎症反应及
                    下游：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′
                                                            氧化应激的影响
        2.6  Rnd3、NF-κB p65、Cleaved Caspase-3、Cleaved           与对照组比较，H/R 组 H9c2 心肌细胞的 LDH 释放
        Caspase-9蛋白表达水平检测                                   量和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，SOD活性
            采用 Western blot 法检测。取各组造模、给药后的                  显著降低（P＜0.05）；与H/R组比较，H/R+AS-L组、H/R+
        H9c2心肌细胞，加入500 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋                     AS-M组、H/R+AS-H组H9c2心肌细胞的LDH释放量和
        白后，加入5×十二烷基硫酸钠上样缓冲液于沸水中煮10                          MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低，SOD活性显著
        min使蛋白变性。取变性蛋白，按照每孔40 μg的密度进                        升高（P＜0.05）；与 H/R+AS-L 组比较，H/R+AS-M 组、
        行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；转移至聚偏                            H/R+AS-H 组 H9c2 心肌细胞的 LDH 释放量和 MDA、
        二 氟乙烯膜后室温封闭 2 h，加入 Rnd3、NF-κ B p65、                 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平及 SOD 活性的上述变化程度更
        Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗稀释液与内参         显著（P＜0.05）；与 H/R+AS-M 组比较，H/R+AS-H 组

        GAPDH抗体稀释液（稀释度分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶                 H9c2 心肌细胞的 LDH 释放量和 MDA、TNF-α、IL-1β、
        800、1 ∶ 800、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育24 h；TBST洗涤，加入辣         IL-6 水平及 SOD 活性的上述变化程度更显著（P＜
        根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 1 ∶                       0.05）。结果见表3。
        3 000）后室温孵育 1 h，暗室内曝光显影。应用 Image J                  3.3  类叶升麻苷对 H/R 诱导 H9c2 心肌细胞 中 Rnd3、
        软件进行分析，以目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值                            NF-κB mRNA及蛋白表达的影响
        比值表示蛋白表达水平。                                             与 对 照 组 比 较 ，H/R 组 H9c2 心 肌 细 胞 中 Rnd3
        2.7 统计学分析                                           mRNA 及蛋白表达水平显著降低，NF-κB p65 mRNA 及
            采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资                      蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与H/R组比较，H/R+
        料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间                          AS-L 组、H/R+AS-M 组、H/R+AS-H 组 H9c2 心肌细胞中
        比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t                         Rnd3 mRNA 及蛋白表达水平显著升高，NF-κB p65
        检验。检验水准α＝0.05。                                      mRNA 及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与 H/R+


        ·544 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5                                    中国药房    2022年第33卷第5期
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