Page 37 - 《中国药房》2022年5期
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oxidative stress and inflammatory reaction （P＜0.05）. CONCLUSIONS Acteoside could regulate Rnd3/NF-κ B pathway by
        promoting the expression of Rnd3 and inhibiting the expression of NF-κB p65，inhibit cardiomyocyte apoptosis，oxidative stress
        and inflammation reaction so as to relieve the H/R-induced cardiomyocyte damage.
        KEYWORDS     acteoside；Rnd3/NF-κB pathway；hypoxia/reoxygenation；H9c2 cardiomyocyte；cell apoptosis；oxidative stress；
        inflammatory reaction


            急性心肌梗死是一种临床常见的心脏疾病，恢复冠                         液（PBS，批号20181215）、结合缓冲液（批号20181224）、
        状动脉血流是其主要治疗措施，但当心肌组织恢复血流                           RIPA 裂解液（批号 20181118）、聚偏二氟乙烯膜（批号
        时，心肌组织损伤可能会加重从而引起心肌缺血再灌注                           20181123）、TBST（批号20181018）购自上海碧云天生物
            [1]
        损伤 。缺氧可引起心肌细胞凋亡从而加重心肌组织损                           技术有限公司；兔抗鼠活化胱天蛋白酶 3 抗体（Cleaved
          [2]
        伤 。研究表明，中药及其活性成分具有抗炎、抗氧化等                          Caspase-3，批号 20190107）、Cleaved Caspase-9 抗体（批
        作用，并可用于减轻心肌缺血再灌注损伤                  [3－4] 。类叶升     号 20190111）、内参 GAPDH 抗体（批号 20190110）与辣
        麻苷（acteoside）是肉苁蓉的主要活性成分，基础研究表                     根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（批 号
        明其对小鼠具有神经保护、调节免疫、抗炎、改善学习记                          20190114）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
                [5]
        忆等作用 。研究发现，Rho 家族 GTP 酶 3（Rho family               1.3 细胞
        GTPase 3，Rnd3）在肝脏缺血再灌注损伤中表达下调，上                        本研究所用大鼠心肌细胞株H9c2购自美国模式培
        调其表达可抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通             养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。
                                          [6]
        路的活化从而减轻肝脏缺血再灌注损伤 。本研究采用                           2 方法
        缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）诱导大鼠 H9c2          2.1  分组、造模和给药
        心肌细胞建立心肌缺血再灌注损伤模型，探讨类叶升麻                               本实验将H9c2心肌细胞分为对照组、H/R组、H/R+
        苷是否通过调控Rnd3/NF-κB通路进而影响H/R诱导的                      AS-L 组、H/R+AS-M 组、H/R+AS-H 组、H/R+pcDNA 组、
        心肌细胞损伤过程。                                          H/R+pcDNA-Rnd3组、H/R+AS-H+si-NC组、H/R+AS-H+
        1 材料                                               si-Rnd3 组。（1）对照组：将 H9c2 心肌细胞接种于 6 孔板
                                                                4
        1.1  主要仪器                                          （1×10 个/孔），于37 ℃、5％CO2的正常培养箱内培养24 h，
            StepOnePlus 型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）                 不进行造模；H/R组：参考文献[7]进行H/R造模，将H9c2
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        仪购自美国 ABI 公司；FACS Calibur 型流式细胞仪购自                 心肌细胞接种于 6 孔板（1×10 个/孔），置于缺氧环境
        美国Beckman Coulter有限公司；DYCP-44N型快速凝胶                （37 ℃、5％CO2、＜6％O2的培养箱）中培养 24 h，然后将
        电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。                                 其置于 37 ℃、5％CO2 的正常培养箱内复氧培养 6 h；
        1.2  主要药品与试剂                                       H/R+AS-L 组、H/R+AS-M 组、H/R+AS-H 组：另取 H9c2
            类叶升麻苷（纯度≥98％，货号 SA8050）、Annexin                心肌细胞分别给予低、中、高浓度（10、30、90 μmol/L）的
                                                                         [8]
        Ⅴ-FITC/PI 试剂盒（批号 20190115）购自北京索莱宝科                 类叶升麻苷处理 ，然后参照“H/R组”进行H/R处理。（2）
        技有限公司；DMEM 培养基（批号20190203）、胎牛血清                    H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-Rnd3组：采用脂质体转染
       （批号 20190205）、Trizol 试剂（批号 20190216）、反转录            法分别将 pcDNA（空载体）、pcDNA-Rnd3（使 Rnd3 过表
        PCR 试剂（批号 20190101）、实时荧光定量 PCR 试剂（批                达）转染至 H9c2 心肌细胞，转染成功后参照“H/R 组”进
        号 20181203）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；       行 H/R 处 理 。（3）H/R + AS-H + si-NC 组 、H/R + AS-H +
        Lipofectamine 2000 转染试剂（批号 20181223）购自美国           si-Rnd3组：采用脂质体转染法分别将si-NC（阴性对照）、
        Invitrogen 有限公司；空载体 pcDNA、Rnd3 过表达载体               si-Rnd3（抑制Rnd3过表达）转染至H9c2心肌细胞，转染
        pcDNA-Rnd3、Rnd3小分子干扰RNA（si-Rnd3）及其阴性               成功后给予 90 μmol/L 的类叶升麻苷处理 ，然后参照
                                                                                                [8]
        对照（si-NC）购自上海吉玛制药技术有限公司；血清乳                       “H/R组”进行H/R处理。每组设9个复孔。
        酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malon-         2.2 细胞凋亡率的检测
        dialdehyde，MDA）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dis-          采用 FACS Calibur 流式细胞仪检测。收集各组造
        mutase，SOD）检 测 试 剂 盒（批 号 分 别 为 20181220、           模、给药后的 H9c2 心肌细胞，加入预冷 PBS 洗涤，弃上
        20190103、20181116）购自南京建成生物工程研究所；肿                  清液后加入500 μL结合缓冲液，然后分别加入5 μL An-
        瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介         nexin Ⅴ-FITC 试剂与 5 μL PI 试剂，充分混匀后室温避
        素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6检测试剂盒（批号分别           光孵育 10 min，于 1 h 内检测细胞凋亡率。严格按照试
        为20181118、20181005、20181018）购自上海酶联生物科              剂盒说明书进行操作。
        技有限公司；兔抗鼠 Rnd3 抗体（批号 20190103）、NF-κB               2.3 LDH释放量、MDA水平、SOD活性检测
        亚基p65（NF-κB p65）抗体（批号20190105）、磷酸盐缓冲                   采用相应试剂盒检测。收集各组造模、给药后的


        中国药房    2022年第33卷第5期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 5  ·543 ·
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