Page 88 - 《中国药房》2022年4期
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分 。岩大戟内酯A、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯                         70％B→100％B；15.00～16.00 min，100％B；16.00～
          [4]
        A 和 17-羟基岩大戟内酯 B 是狼毒大戟中含量较高且活                       16.10 min，100％B→20％B；16.10～18.00 min，20％B）；
                          [5]
        性较强的二萜类成分 。                                         柱温为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为2 μL。
            在早期的药物-药物相互作用研究中，体外肝微粒                          2.1.2 质谱条件
                                           [6]
        体孵育体系是探讨药物代谢的重要模型 。体外代谢研                                离子源为电喷雾离子源；离子喷雾电压为 5.5 kV；
        究可在新药研发早期利用体外代谢参数合理预测候选                             离子源温度为 600 ℃；去簇电压为 100 V；碰撞能量为
        化合物的体内药动学行为，指导其后期药动学、药效学                            10 eV。雾化气、辅助气和气帘气均为氮气，其压力分别
                                     [7]
        研究以及安全性评价模型的选择 。本研究拟采用大鼠                            为 55、55、35 psi。在正离子模式下进行全扫描，累计时
        肝微粒体体外孵育法结合超高效液相色谱-四极杆-飞行                           间为250 ms。采用数据依赖采集模式进行分析，即对每
        时间质谱联用技术研究狼毒大戟中岩大戟内酯A、岩大                            个分析物中质谱响应超过100 cps的15个最强碎片离子
        戟内酯 B、17-羟基岩大戟内酯 A 和 17-羟基岩大戟内酯                     进行子离子扫描，扫描范围为 100～1 200 amu，累计扫
        B的代谢产物，并对其可能的裂解途径进行推测，探讨其                           描时间为 100 ms。碰撞能量差为 15 eV，并开启动态背
        代谢规律，旨在为这4种二萜类活性成分的代谢途径及                            景扣除。采用自动校准系统对质谱和质谱/质谱自动进
        在体药动学研究奠定基础。                                        行调谐和校正。数据获取和处理分析采用 Analyst TF
                                                                                                        ®
        1 材料                                                1.7.1 和 PeakView 2.2 软件，利用 MetabolitePilot 1.5 和
                                                                           ®
        1.1 主要仪器                                            MasterView 1.2软件对代谢产物进行推测与鉴定。
            本研究所用主要仪器包括 30A 型超高效液相色谱                        2.2 溶液的配制
        仪（日本 Shimadzu 公司）、Triple TOF 4600 型质谱仪（美            2.2.1 磷酸盐缓冲液
        国 AB Sciex 公司）、AB135-S 型分析天平（瑞士 Mettler                 精密称取磷酸氢二钠1.496 g，用水定容于50 mL量
        Toledo 公司）、Elix Essential 5 UV 型纯水仪（美国 Merck        瓶中；再精密称取磷酸二氢钾1.361 g，用水定容于50 mL
        Millipore公司）、B8800型超声波清洗器（美国Branson公                量瓶中；将上述配制的磷酸二氢钾溶液逐滴加入到磷酸
        司）、Centrifuge 5417R 型离心机（德国 Eppendorf 公司）、          氢二钠溶液中，直至所得混合溶液的pH为7.4，即得。
        HYQ-2121A型涡旋混匀器（美国Crystal公司）等。                      2.2.2 氯化镁溶液
        1.2  主要药品与试剂                                            精密称取氯化镁 0.953 g，用水定容于 200 mL 量瓶
            岩大戟内酯 A、岩大戟内酯 B、17-羟基岩大戟内酯                      中，得5 mmol/L的氯化镁溶液。
        A 和 17-羟基岩大戟内酯 B 对照品（批号分别为 EF-1、                    2.2.3 NADPH溶液
        EF-2、EF-3、EF-4，经高效液相色谱法检测纯度均大于                          精密称取 NADPH 10 mg，加水 0.6 mL，混匀，得 4
        98％）均由齐齐哈尔医学院医药科学研究院天然药物化                           mmol/L的NADPH溶液，现用现配。
        学实验中心制备；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自                          2.2.4 样品溶液
        美国Merck公司；甲酸（质谱纯）购自美国Thermo Fisher                      分别精密称取岩大戟内酯 A、岩大戟内酯 B、17-羟
        Scientific 公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（re-                   基岩大戟内酯 A 和 17-羟基岩大戟内酯 B 对照品适量，
        duced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，  加入一定量的二甲基亚砜进行溶解，使上述各成分的质
        NADPH）购自大连美仑生物技术有限公司；磷酸二氢                           量浓度均为1 mg/mL，即得。
        钾、磷酸氢二钠、氯化镁均购自天津市科密欧化学试剂                            2.3  大鼠肝微粒体体外孵育实验
        有限公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水                                孵育体系包含 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液 100 μL、水
        为纯化水。                                               49 μL、肝微粒体10 μL、5 mmol/L氯化镁溶液20 μL。本
        1.3 肝微粒体                                            研究设实验组（肝微粒体代谢后组）和阴性组（肝微粒体
            大鼠肝微粒体（批号 M10011，质量浓度 20 mg/mL）                 代谢前组）。两组孵育体系中分别加入1 mg/mL的岩大
        购自武汉普莱特生物医药技术有限公司。                                  戟内酯A、岩大戟内酯B、17-羟基岩大戟内酯A、17-羟基
        2 方法与结果                                             岩大戟内酯 B 样品溶液各 1 μL，在 37 ℃下预孵育 5
        2.1 色谱与质谱条件                                         min。然后，实验组加入4 mmol/L的NADPH溶液20 μL
        2.1.1 色谱条件                                          启动反应，在 37 ℃下继续孵育 30 min 后，加入冰乙腈
            以 Phenomenex C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）为色       600 μL 终止反应；阴性组先加入冰乙腈 600 μL，再加入
        谱柱，以 0.1％甲酸溶液（A）-0.1％甲酸乙腈溶液（B）为                     4 mmol/L 的 NADPH 溶液 20 μL，在 37 ℃条件下继续孵
        流动相进行梯度洗脱（0～0.01 min，20％B，0.01～1.00                 育 30 min。取各组样品，涡流混匀 30 s，以 14 000 r/min
        min，20％B→30％B；1.00～7.00 min，30％B→50％B，              离心10 min，取上清液于另一EP管中，于37 ℃下以氮气
        7.00～10.00 min，50％B→70％B；10.00～15.00 min，           流吹干，残渣加甲醇200 μL复溶，再以14 000 r/min离心


        ·466 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 4                                    中国药房    2022年第33卷第4期
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