Page 64 - 《中国药房》2022年3期
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是抗病毒，但存在一定局限性，不能完全抑制肝纤维化                            购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标
        的形成和进展，临床上仍缺乏针对纤维组织增生和降解                            记的山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号 70-GRT007）购
                   [2]
        的治疗措施 。因此，开发能够阻止甚至逆转肝纤维化                            自杭州联科生物技术股份有限公司；ECL 发光试剂盒
        的药物对治疗慢性肝病、防治肝硬化具有重要意义。                            （批号 SB-WB012）购自上海圣尔生物科技有限公司；
            仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙芽草Agrimonia                      Col-Ⅰ酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosor-
        pilosa Ledeb.的全草，又名脱力草、龙牙草、马鞭草、石打                   bent assay，ELISA）试剂盒（批号 xl-Eh0746）购自北京丽
        穿等，最早见于《淮南草本》。仙鹤草味苦、涩、平，归肺、                         科创欣生物科技有限公司；CCK8试剂盒（批号CK04）购
        肝、脾经，主要用于治疗各种出血证、痢疾、虚痨等病 。                          自日本Dojindo公司；Annexin Ⅴ-PE/7-AAD流式试剂盒
                                                      [3]
        仙鹤草的主要成分有酚类、黄酮类、多糖类、三萜类、鞣                          （批号 WE0328）购自北京百奥莱博科技有限公司；血小
                         [4]
        质以及微量元素等 。现代药理学研究表明，仙鹤草具                            板衍生生长因子 BB（platelet derived growth factor BB，
        有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抗氧化的活性                    [5－7] 。本   PDGF-BB，批号 315-18）购自美国 PeproTech 公司；其余
        课题组前期通过临床观察及实验研究发现，仙鹤草具有                            试剂为实验室常用规格，水为纯净水。
        减轻肝纤维化的作用，但具体药效成分以及作用机制尚                            1.3 细胞
        不明确。基于此，本研究拟探讨仙鹤草不同极性部位对                                本研究所用大鼠肝星状细胞HSC-T6由重庆医科大
        大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSCs）增殖及凋亡            学附属第二医院病毒性肝炎研究所彭明利教授惠赠。
        的影响，以期为仙鹤草抗肝纤维化的药效成分开发提供                            2 方法
        参考。                                                 2.1 细胞培养
        1 材料                                                    将 HSC-T6 细胞培养于含 10％胎牛血清和 1％青霉
        1.1  主要仪器                                           素-链霉素双抗的 DMEM 培养基（以下简称“培养基”）
            本研究所用主要仪器有 Vortex-5 型涡旋振荡仪（海                    中，置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至对
        门市其林贝尔仪器制造有限公司），CCT-3320A 型超纯                       数期时，进行后续实验。
        水 机（重 庆 力 德 高 端 水 处 理 设 备 研 发 有 限 公 司），             2.2  仙鹤草不同提取部位的制备
        YP202N 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公                              称取 2.5 kg 粉碎后的仙鹤草放入渗漉筒中，加入 5
        司），HH-601 型恒温水浴箱（江苏金坛市华欧实验仪器                        倍量（L/kg）95％乙醇浸泡，使用脱脂棉进行过滤，重复
        厂），MCO-15AC-SC 型二氧化碳培养箱（日本 Sanyo 公                  操作3次；合并滤液，使用旋转蒸发仪减压回收乙醇，得
        司），Mini-PROTEAN Tetra 1658001 型垂直电泳装置、              到总粗提物126 g。取部分总粗提物以温水溶解使之充
        CFX96型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），TS-2000A                  分混悬分散，然后依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分
        型脱色摇床（海门市麒麟医用仪器厂），ELX800 型酶标                        别萃取 3～5 次，合并各萃取液并分别减压浓缩、回收溶
        仪（美国Bio-Tek公司），TG16-WS型高速台式离心机（湖                    剂，得到石油醚部位2.031 g、乙酸乙酯部位1.895 g、正丁
        南湘仪实验室仪器开发有限公司），DW-86L388J 型                        醇部位2.244 g。各萃取物以DMSO溶解备用。
        －80 ℃超低温冰箱（海尔生物医疗股份有限公司）。                           2.3  HSC-T6细胞增殖活性的检测
        1.2  主要药品与试剂                                            采用 CCK8 法进行检测。取对数生长期的 HSC-T6
            仙鹤草（批号210300451）购自康美药业股份有限公                     细胞（密度为2×10 mL ）接种于96孔板中，然后分为对
                                                                           4
                                                                               －1
        司，由重庆市中医院药剂科王琴主任中药师鉴定为龙牙                            照组、仙鹤草总提取物不同浓度组、仙鹤草乙酸乙酯部
        草A. pilosa Ledeb.的干燥地上部分。DMEM培养基（批                  位不同浓度组、仙鹤草石油醚部位不同浓度组、仙鹤草
        号 SH30809.01）购自美国 HyClone 公司；优级胎牛血清                 正丁醇部位不同浓度组。对照组加入培养基，各给药组
        （批号st30-3302p）购自德国PAN Biotech公司；蛋白提取                加入相应含药培养基（药物质量浓度均分别为 0.5、5、
        试 剂 盒（批 号 p0013B）、二 甲 基 亚 砜（DMSO，批 号                50、500、5 000 μg/mL，均以生药量计，根据本课题组前期
        ST038）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗鼠α-平                        预实验结果设置），另设不加药物和细胞的空白组，培养
        滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）单克           24、48、72 h后，每组取9孔细胞加入5 g/L CCK8溶液10
        隆抗体、兔抗鼠 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma-2，                μL；继续培养4 h后弃去上清液，加入DMSO 100 μL，振
        Bcl-2）单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-asso-               荡10 min；采用酶标仪于450 nm波长下检测每孔光密度
        ciated X protein，Bax）单克隆抗体、兔抗鼠胱天蛋白酶 3              （optical density，OD）值，并计算细胞增殖抑制率和半数
        （caspase-3）单克隆抗体、兔抗鼠β-肌动蛋白（β-actin）单                抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50 ）。其中，细
        克隆抗体（批号分别为 19245T、3498、2772T、14220T、                胞增殖抑制率＝1－（给药组平均 OD 值－空白组平均
        3700S）均购自美国Cell Signaling公司；兔抗鼠Ⅰ型胶原                 OD 值）/（对照组平均 OD 值－空白组平均 OD 值）×
        蛋白（collagen Ⅰ，Col-Ⅰ）多克隆抗体（批号 bs-7158R）              100％。


        ·314 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 3                                    中国药房    2022年第33卷第3期
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