Page 60 - 《中国药房》2022年3期
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nm 波长下检测各孔的吸光度，吸光度越大表明细胞存 白条带灰度值比值表示这 3 种蛋白的表达水平，以
活数量越多、药物毒性越低。 p-NF-κB p65 与 NF-κB p65、p-IKK 与 IKK、p-p38 MAPK
2.4 分组、造模与给药 与p38 MAPK、p-ERK与ERK、p-JNK与JNK的蛋白条带
－1
5
将细胞以 1×10 mL 接种于 96 孔板中或以 8×10 5 灰度值比值表示这5种蛋白的磷酸化水平。
mL 接种于 6 孔板，然后分为空白组、模型组、牛膝组 2.7 统计学分析
－1
（800 μg/mL）、杜仲组（800 μg/mL）和牛膝-杜仲药对低、 采用 GraphPad Prism、SPSS 19.0 软件进行数据分
中、高浓度组（400、800、1 600 μg/mL），上述各给药浓度 析，数据以x±s表示；多组间比较采用单因素方差分析；
根据本课题组前期预实验结果设置。空白组和模型组 组间两两比较时，若方差齐则采用最小显著性差异法
加入培养基，其余各组加入含相应药物的培养基，培养 （LSD），若方差不齐则采用 Dunnett’s T3 多重比较。检
6 h；弃去培养基，空白组加入培养基，模型组加入含 10 验水准α＝0.05。
μg/mL 脂多糖的培养基（以复制炎症模型），其余各组加 3 结果
入含相应药物和 10 μg/mL 脂多糖的培养基，继续培养 3.1 牛膝-杜仲药对的细胞毒性考察结果
18 h，再进行后续实验。 与空白组比较，单一药材不同浓度组和牛膝-杜仲
2.5 牛膝-杜仲药对对细胞中炎症因子表达的影响及联 药对不同浓度组细胞吸光度差异无统计学意义（P＞
合作用评价 0.05），表明牛膝、杜仲的单一药材或两者组成药对后均
对RAW264.7细胞的生长无毒性作用，结果见表1、表2、
采用 Griess 法和 ELISA 法进行检测。将细胞以 1×
表3。
5
－1
10 mL 接种于 96 孔板中，每孔 0.2 mL，按“2.4”项下方
表1 牛膝的细胞毒性考察结果（x±±s，n＝6）
法分组、造模与给药，每组设置6个复孔。细胞培养结束
组别 吸光度 组别 吸光度
后，取上清液，按照NO含量测定试剂盒和相应ELISA说
空白组 1.30±0.05 牛膝200 μg/mL组 1.30±0.16
明书相关方法操作，检测细胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α 牛膝50 μg/mL组 1.38±0.04 牛膝400 μg/mL组 1.29±0.11
的水平，并计算各炎症因子抑制率[抑制率＝（模型组炎 牛膝100 μg/mL组 1.30±0.09 牛膝800 μg/mL组 1.24±0.05
症因子水平－给药组炎症因子水平）/模型组炎症因子水 表2 杜仲的细胞毒性考察结果（x±±s，n＝6）
组别 吸光度 组别 吸光度
EA+B
平×100％]。另外，采用金氏公式（Q＝ ） 空白组 0.91±0.05 杜仲200 μg/mL组 0.93±0.08
EA+EB－EA×EB
杜仲50 μg/mL组 0.93±0.07 杜仲400 μg/mL组 0.91±0.06
评价牛膝-杜仲药对的联合作用，其中EA、EB分别表示牛 杜仲100 μg/mL组 0.91±0.06 杜仲800 μg/mL组 0.96±0.05
膝、杜仲单独作用时的炎症因子抑制率，EA+B表示牛膝、 表3 牛膝-杜仲药对的细胞毒性考察结果（x±±s，n＝6）
杜仲联合作用后的炎症因子抑制率（此处以牛膝-杜仲 组别 吸光度 组别 吸光度
药对高浓度组所得抑制率结果进行计算）；当 Q 值大于 空白组 1.34±0.16 牛膝-杜仲药对400 μg/mL 1.39±0.14
牛膝-杜仲药对100 μg/mL 1.31±0.07 牛膝-杜仲药对800 μg/mL 1.39±0.14
1.15时表示两者具有协同作用，当Q值小于0.85时表示
牛膝-杜仲药对200 μg/mL 1.42±0.06 牛膝-杜仲药对1 600 μg/mL 1.37±0.06
[8]
两者具有拮抗作用 。
3.2 牛膝-杜仲药对对细胞中炎症因子表达的影响及联
2.6 牛膝-杜仲药对对细胞中炎症相关蛋白表达的影响
合作用评价结果
采用 Western blot 法进行检测。将细胞以 8×10 5
与空白组比较，模型组细胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α
mL 接种于 6 孔板中，按“2.4”项下方法分组、造模与给
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水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，杜仲组细胞
药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，弃去培养基，以
中 NO 水平显著降低（P＜0.01），牛膝-杜仲药对各浓度
PBS洗涤2～3次，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，并 组细胞中上述指标水平大部分显著降低（P＜0.05或P＜
置于冰上充分裂解 30 min 后，于 4 ℃条件下以 12 000 0.01），结果见表4。另外，牛膝、杜仲联合作用后，对NO、
r/min 离心 15 min；取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓 IL-1β、IL-6 和 TNF-α抑制率的 Q 值分别为 3.43、1.29、
度。蛋白经煮沸变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯 1.37、1.97，均大于1.15，表明两者具有协同抗炎作用。
酰胺凝胶电泳；转膜，以 5％脱脂奶粉封闭 2 h；加入 3.3 牛膝-杜仲药对对细胞中炎症相关蛋白表达的影响
iNOS、COX-2、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IKK、IKK、 与空白组比较，模型组细胞中iNOS、COX-2蛋白的
IκBα、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK、p-JNK、 表达水平和 NF-κB p65、IKK、p38 MAPK、ERK、JNK 蛋
JNK、GAPDH一抗（稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜； 白的磷酸化水平均显著升高（P＜0.01），IκBα蛋白表达
以TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（稀释度为1∶3 000）， 水平均显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，牛膝组、杜
室温孵育2 h；以TBST洗膜10 min×3次，加入ECL化学 仲组以及牛膝-杜仲药对各浓度组细胞中上述蛋白的表
发光试剂，采用凝胶成像系统成像。采用Image J 6.0软 达水平或磷酸化水平大部分显著逆转（P＜0.05 或 P＜
件进行分析，以iNOS、COX-2、IκBα与内参GAPDH 的蛋 0.01）。结果见图1、表5。
·310 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 3 中国药房 2022年第33卷第3期
