Page 59 - 《中国药房》2022年3期
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牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干           （inducible nitric oxide synthase，iNOS）多克隆抗体、兔源
        燥根，具有补肝肾、强筋骨、祛瘀通络和引血下行的作                           环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）多克隆抗体、兔源
        用，主要含有多糖、多肽、三萜皂苷类、酮甾类、甾醇类、                         核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65）
        生物碱类等化学成分，具有抑制神经细胞凋亡、调节免                           多克隆抗体、兔源磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克
        疫相关细胞因子等作用 。杜仲是杜仲科植物杜仲 Eu-                         隆抗体、兔源 NF-κB 抑制蛋白α（inhibitor α of NF-κB，
                            [1]
        commia ulmoides Oliver.的树皮，在我国有两千多年的用              IκBα）多克隆抗体、兔源IκB激酶（IκB kinase，IKK）多克
        药历史，《神农本草经》中将其列为上品，主要用于治疗                          隆抗体、兔源磷酸化IKK（p-IKK）多克隆抗体、兔源p38
        肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等疾病，是中                          丝裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein
        医骨伤科治疗骨关节炎的常见药物，被广泛应用于中药                           kinase，p38 MAPK）多克隆抗体、兔源磷酸化p38 MAPK
                          [2]
        方剂或中成药配伍中 。                                        （p-p38 MAPK）多克隆抗体、兔源胞外信号调节激酶
            药对又称为对药、对子，由临床上相对固定的2味药                        （extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗体、
        材配伍而成，具有中药配伍的基本特点。《中药药对大                           兔源磷酸化 ERK（p-ERK）多克隆抗体、兔源 c-Jun N 端
        全》中将牛膝、杜仲列为药对，使两者补肝肾、强筋骨之                          激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗体、兔源磷
              [3]
        力倍增 。壮筋养血汤、补肾养血化瘀汤、补益干漆丸、                          酸化 JNK（p-JNK）多克隆抗体、兔源 GAPDH 多克隆抗
        杜仲丸和独活寄生汤均为我国治疗骨关节炎的传统方                            体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗
        剂，这些方剂中均含有牛膝、杜仲 2 味药材               [4－5] 。骨关节     （美国Cell Signing Technology公司，批号分别为#13120S、
                                                [6]
        炎是一种以炎症和软骨退化为特征的关节疾病 。基于                           #3033、#12282、#11930、#4814、#8242、#2697、#4511、#8690、
        此，本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，以脂                       #4370、#4695、#4668、#9252、#13120S、#7074S）；其余试
                                [7]
        多糖诱导建立细胞炎症模型 ，从体外层面考察牛膝-杜                          剂为实验室常用规格，水为纯净水。
        仲药对的协同抗炎作用，为阐明该药对治疗骨关节炎的                           1.3  细胞
        机制提供实验基础。                                              本研究所用小鼠巨噬细胞RAW264.7受赠于浙江中
        1 材料                                               医药大学张巧艳教授课题组。
        1.1  主要仪器                                          2 方法
            本研究所用主要仪器有 SW-CJ-2FD 型双人单面超                    2.1  单一药材水提液和牛膝-杜仲药对水提液的制备
        净台（苏州净化设备有限公司）、MCO-15AC型CO2恒温                          取牛膝 10 g、杜仲 10 g 分别加 10 倍量水（mL/g，下
        培养箱（日本 Sanyo 公司）、DMI3000 型倒置相差显微镜                  同）浸泡过夜，煎煮至沸腾后保持微沸 15 min，过滤；再
       （美国Leica公司）、Synergy LX型连续波长酶标仪（美国                   加等量水重复煎煮，提取 2 次，过滤；合并 3 次滤液并浓
        Bio-Tek公司）、LDZX-30KB型高压灭菌锅（上海申安医                   缩成浸膏。另外，取牛膝10 g、杜仲10 g混合，加入10倍
        疗器械厂）、LP502 型电子天平（常熟市衡器厂）、WD-                      量水浸泡过夜，再同上述方法煎煮、过滤，浓缩成浸膏。
        9413B型凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）。                        再将单味药以及药对的浸膏加水溶解，均制成生药量为
        1.2  主要药品和试剂                                       10 mg/mL的药液。
            本研究所用主要药品有牛膝、生杜仲（上海虹桥中                         2.2  细胞培养
        药饮片公司，批号分别为 210326、191231），经海军军医                       将 RAW264.7 细胞复苏，以含 5％胎牛血清、1％双
        大学第三附属医院药剂科鲍蕾蕾副主任药师鉴定为真                            抗（青霉素和链霉素）的 DMEM 高糖培养基（以下简称
        品。主要试剂有 DMEM 高糖培养基、胎牛血清（美国                        “培养基”）置于 37 ℃、5％CO2 培养，待细胞融合度达
        Gibco 公司，批号分别为 p002548、10099）；CCK-8 试剂             70％～80％时进行传代，然后进行后续实验。
        盒、Western 及 IP 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、一                 2.3 牛膝-杜仲药对的细胞毒性考察
                                                                             5
        氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒（上海碧云天生物                      将细胞以 1×10 mL      － 1  接种于 96 孔板中，每孔 0.2
        技 术 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 C0038、P0013、P0012、          mL，然后分为空白组、牛膝不同浓度组（50、100、200、
        S0021M）；ECL 化学发光剂（北京 Biosharp 公司，批号                400、800 μg/mL，以生药质量浓度计，下同）、杜仲不同浓
        BL520B）；小鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶联免            度组（50、100、200、400、800 μg/mL）、牛膝-杜仲药对不同
        疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）     浓度组（100、200、400、800、1 600 μg/mL），上述各给药浓
        试剂盒、小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α                   度根据本课题组前期预实验结果设置。各组细胞培养
       （tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（江苏酶        24 h后，吸弃培养基，空白组加入培养基100 μL，其余各
        免 实 业 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 MM-0163M2、                组加入含相应药物的培养基 100 μL；培养 24 h 后，按
        MM-0040M1、MM-0040M1）；兔源诱导型一氧化氮合酶                   CCK-8 试剂盒说明书方法操作，然后采用酶标仪于 450


        中国药房    2022年第33卷第3期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 3  ·309 ·
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