Page 21 - 《中国药房》2022年1期

4 mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），
冰浴备用。细胞培养结束后，以2 000 r/min在4 ℃离心
3～4 min，沉淀细胞，弃上清液，注意尽量不要吸除细胞；
加入1 mL JC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，以2 000 r/min
在 4 ℃离心 3～4 min，沉淀细胞，弃上清液，再用适量
JC-1染色缓冲液（1×）重悬后，进行线粒体膜电位荧光强 A.正常组 B.缺氧模型组
度定量检测。检测 JC-1 单体时，最大激发波长为 490
nm，最大发射波长为 530 nm；检测 JC-1 聚合物时，最大
激发波长为 525 nm，最大发射波长为 590 nm。结果解
析：横坐标表示绿色荧光强度，纵坐标表示红色荧光强
度，当红/绿荧光强度比值降低时，表示细胞线粒体膜电
位降低。 C.阿魏酸甲酯高剂量组 D.阿魏酸甲酯中剂量组
2.7 H9c2心肌细胞线粒体膜通透性转换孔开放情况的
检测
采用流式细胞仪检测。将细胞接种于6孔板，37 ℃
培养箱贴壁培养。将细胞按照“2.2”项下方法分组处理
后，使用胰酶消化细胞，加入终止液，以1 500 r/min离心
5 min，收集细胞；用 PBS 洗涤 1～2 次，离心收集细胞沉 E.阿魏酸甲酯低剂量组 F.阳性对照药组
淀；加入 200 μL 荧光淬灭工作液（在 Calcein AM 染色液 图1 各组H9c2心肌细胞经处理后的显微图（×100）
中添加CaCl2 ），颠倒数次混匀，在37 ℃细胞培养箱中培 表 1 各组 H9c2 心肌细胞中 LDH、MDA、CK、ATP 的
养 30 min。细胞培养结束后，以 1 500 r/min 离心 5 min， 检测结果（x±±s，n＝3）
收集沉淀细胞；使用 PBS 洗涤 2 次，再用 200 μL PBS 重 组别 LDH/（U/L） MDA/（nmol/mL） CK/（U/mL） ATP/（nmol/L）
悬细胞，进行线粒体膜通透性转换孔荧光强度定量检 正常组 31.82±8.22 1.99±0.12 0.23±0.1 5 190.83±34.17
测。检测的最大激发波长为 494 nm，最大发射波长为 缺氧模型组 148.08±4.09 a 6.90±0.25 a 0.45±0.01 a 699.94±9.67 a
阿魏酸甲酯高剂量组 74.85±10.95 b 2.40±0.16 b 0.27±0.01 b 4 060.22±96.84 b
517 nm。结果解析：以绿色荧光的强弱表示线粒体膜 阿魏酸甲酯中剂量组 102.67±14.33 b 2.96±0.19 b 0.33±0.01 b 2 949.33±76.13 b
通透性转换孔的开放程度，绿色荧光越强，开放程度 阿魏酸甲酯低剂量组 116.76±12.99 c 4.46±0.13 b 0.38±0.01 c 1 722.33±64.36 b
阳性对照药组 119.83±4.67 c 4.79±0.13 b 0.40±0.01 c 1 531.89±41.74 b
越低。
a：与正常组比较，P＜0.01；b：与缺氧模型组比较，P＜0.01；c：与缺
2.8 统计学分析
氧模型组比较，P＜0.05
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料
满足正态分布时以x±s表示，多组间比较采用单因素方 荧光强度显著升高（P＜0.01）；与缺氧模型组比较，阿魏
差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝ 酸甲酯高、中、低剂量组及阳性对照药组H9c2心肌细胞
0.05。 中 ROS 荧光强度均显著降低（P＜0.01 或 P＜0.05）。结
3 结果 果见图2。
3.1 H9c2心肌细胞形态观察结果 3.4 阿魏酸甲酯对H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响
倒置显微镜下可见，各组H9c2心肌细胞经处理后， 与正常组比较，缺氧模型组 H9c2 心肌细胞线粒体
细胞形态饱满，均一性良好（图 1），表明阿魏酸甲酯高、 膜电位的红/绿荧光强度比值显著降低（P＜0.01）；与缺
中、低剂量和阳性对照药对 H9c2心肌细胞均无毒性。 氧模型组比较，阿魏酸甲酯高、中、低剂量组及阳性对照
3.2 阿魏酸甲酯对H9c2心肌细胞生化指标的影响 药组H9c2心肌细胞线粒体膜电位的红/绿荧光强度比值
与正常组比较，缺氧模型组H9c2心肌细胞中LDH、 均显著升高（P＜0.01）。结果见图3。
MDA、CK 水平均显著升高，ATP 水平显著降低（P＜ 3.5 阿魏酸甲酯对H9c2心肌细胞线粒体膜通透性转换
0.01）；与缺氧模型组比较，阿魏酸甲酯高、中、低剂量组 孔开放情况的影响
及阳性对照药组H9c2心肌细胞中LDH、MDA、CK水平 与正常组比较，缺氧模型组 H9c2 心肌细胞线粒体
均 显 著 降 低 ，ATP 水 平 均 显 著 升 高（P＜0.01 或 P＜ 膜通透性转换孔绿色荧光强度显著降低（P＜0.01）；与
0.05）。结果见表1。 缺氧模型组比较，阿魏酸甲酯高、中、低剂量组及阳性对
3.3 阿魏酸甲酯对H9c2心肌细胞中ROS的影响 照药组H9c2心肌细胞线粒体膜通透性转换孔绿色荧光
与正常组比较，缺氧模型组 H9c2 心肌细胞中 ROS 强度均升高（P＜0.01或P＜0.05）。结果见图4。

中国药房 2022年第33卷第1期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1 ·15 ·