Page 20 - 《中国药房》2022年1期
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1 材料                                                将细胞维持在含有复合成分缓冲液（NaCl 137 mmol/L、
        1.1 主要仪器                                            KCl 12 mmol/L、MgCl2 0.5 mmol/L、CaCl2 0.9 mmol/L、羟
            本研究所用主要仪器有：YXQ-LS-100A 型电热压                     乙基哌嗪乙硫磺酸 20 mmol/L、2-脱氧-D-葡萄糖 20
        力蒸汽消毒器、GZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱、                       mmol/L，pH6.2）中诱导缺氧，并于 37 ℃、0.1％O2、5％
        SW-CJ-2F型超净工作台、BSC-1300ⅡA2型生物安全柜                    CO2、95％N2的缺氧培养箱中放置 1 h；阿魏酸甲酯各剂
        （上海博讯实业有限公司），TDL-50B型低速台式离心机                        量组：在缺氧造模前加入高、中、低剂量的阿魏酸甲酯
        （上海安亭科学仪器厂），TG16-WS 型高速台式离心机                       （浓度分别为40、20、10 μmol/L）预处理1 h，再按照“缺氧
        （长沙湘仪离心机仪器公司），ECLIPSE Ti-s型倒置荧光                     模型组”的方法进行处理；阳性对照药组：在缺氧造模前
        显微镜（日本 Nikon 公司），细胞计数板（上海医用仪器                       加入环孢菌素A 1 μmol/L预处理1 h，再按照“缺氧模型
        厂），细胞培养瓶及细胞培养板（美国 CoStar 公司），                       组”的方法进行处理。实验中阿魏酸甲酯和环孢菌素剂
        XB120A 型电子分析天平（瑞士 Precisa 公司），ELX800                量根据前期预实验结果进行设置。每组重复实验3次。
        酶联免疫检测仪（美国Bio-Tek公司），MCO-15AC-SC型                   2.3 H9c2心肌细胞形态的观察
        CO2 培养箱（日本 Sanyo 公司），Cytoflex 型流式细胞仪                    将细胞按照“2.2”项下方法分组处理后，置于倒置显
        （美国Beckman Coulter公司）。                              微镜下观察H9c2心肌细胞形态的变化。
        1.2 主要药品及试剂                                         2.4 H9c2心肌细胞上清液中生化指标的检测
            阿魏酸甲酯、环孢霉素A均购自河南奥科标准物质                              将细胞按照“2.2”项下方法分组处理后，采用相应的
        科技有限公司（批号分别为BD105676、C106893，纯度分                    生化指标试剂盒检测。用无菌管收集细胞培养上清液，
        别为99％、98％）；DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美                        以3 000 r/min离心20 min后收集上清液，采用相应试剂
        国Gibco公司（批号分别为11995-065、10099-141）；胰蛋               盒检测 LDH、MDA、CK 的水平。以 PBS（pH 7.2～7.4）
                                                                                          6
        白酶、青霉素-链霉素溶液（100×）、0.25％胰蛋白酶、线粒                     稀释细胞悬液，使细胞密度达 1×10 mL 左右，通过反
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        体膜通透性转换孔检测试剂盒、ROS检测试剂盒购自上                           复冻融，使细胞破坏并释放出细胞内成分，以2 500 r/min
        海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司（批 号 分 别 为 C0201、            离心 20 min，收集上清液，采用 ATP ELISA 试剂盒检测
        C0222、C0201、C2009S、S0033）；JC-1线粒体膜电位检测              ATP的水平。
        试 剂 盒 购 自 上 海 翊 圣 生 物 科 技 有 限 公 司（批 号               2.5  H9c2心肌细胞中ROS的检测
        40706ES60）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）购自               采用流式细胞仪检测。使用胰酶消化细胞，将细胞
        北京中杉金桥生物技术有限公司（批号 B040100）；乳酸                       悬液转移到 15 mL 离心管中，以 1 500 r/min 离心 5 min，
        脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒、丙二              去除上清液，加入新鲜DMEM完全培养基，并用移液管
        醛（malondialdehyde，MDA）检 测 试 剂 盒 、肌 酸 激 酶            将细胞吹打均匀。用细胞计数板计数细胞悬液的密度，
        （creatine kinase，CK）检测试剂盒购自南京建成科技有                  使细胞密度达5×10 mL 左右。将细胞悬液接种至6孔
                                                                                －1
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        限公司（批号分别为 A020-2-2、A003-1-1、A032-1-1）；大             板，于 37 ℃培养箱中培养。将细胞按照“2.2”项下方法
        鼠 ATP ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司                       分组处理后，使用胰酶消化细胞，加入DMEM完全培养
        （批号 ml059183）；其余试剂均为分析纯或实验室常用                       基终止消化，制成细胞悬液，以 3 500 r/min 离心 5～10
        规格。                                                 min 收集细胞；使用 PBS 洗涤 1～2 次，离心收集细胞沉
        1.3  细胞                                             淀，每管加入 100 μL ROS 检测染色液，以 37 ℃培养 30
            本研究所用细胞为大鼠 H9c2 心肌细胞株，购自中                       min后离心，收集细胞；使用PBS洗涤细胞1～3次，再用
        国科学院上海细胞库。                                          200 μL PBS重悬细胞，进行ROS荧光强度定量检测。检
        2 方法                                                测的最大激发波长为 490 nm，最大发射波长为 525 nm。
        2.1 H9c2心肌细胞培养                                      结果解析：平均荧光强度值越大，细胞中产生的 ROS
             H9c2 心肌细胞培养于含 10％胎牛血清、1％青霉                     越多。
        素-链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基中，2～3 d 更换 1                     2.6 H9c2心肌细胞线粒体膜电位的检测
        次培养液，在细胞融合度为80％时按照1 ∶ 3比例进行传                            采用流式细胞仪检测。将细胞接种于 6 孔板，于
        代，于37 ℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。                           37 ℃培养箱贴壁培养。将细胞按照“2.2”项下方法分组
        2.2  分组、造模及给药                                       处理后，使用胰酶消化细胞，以 1 500 r/min 离心 5 min
            将细胞分为 6 组：正常组，缺氧模型组，阿魏酸甲酯                       后，于0.5 mL细胞培养液中重悬，加入0.5 mL JC-1染色
        高、中、低剂量组，阳性对照药组。正常组：细胞常规培                           工作液，颠倒数次混匀，于 37 ℃细胞培养箱中培养 20
        养2 h，不进行造模；缺氧模型组：参照文献[9－13]造模，                      min。在培养期间，按照1 mL JC-1染色缓冲液（5×）加入


        ·14 ·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1                                    中国药房    2022年第33卷第1期
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