Page 65 - 《中国药房》2021年07期
P. 65

表1 PCR引物序列及产物长度                          son染色；剖取回肠，部分用4％多聚甲醛固定，用于免疫
          Tab 1 PCR primer sequence and product length     荧光检测，其余部分于－80 ℃冻存，用于RT-PCR检测；
         基因               序列（5′→3′）             产物长度，bp    剖取结肠，用2.5％戊二醛固定，用于透射电镜观察。
         Occludin    上游：TAGTGGAGGCATTGGAGGAAGTGG  124      2.3 大鼠血清和尿液中肾功能指标的检测
                     下游：CAGGGCGGCGATGAAGATGATG
         ZO-1        上游：GCGAACAGAAGGAGCGAGAAGAG   112          取“2.2”项下采集的尿液和血清样本，按照相关试剂
                     下游：GCTTTGCGGGCTGACTGGAG               盒说明书进行操作，采用全自动生化分析仪检测血清中
         GADPH       上游：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG     129      Scr、BUN 含量和尿液中 Ucr 含量，并计算肌酐清除
                     下游：CGACATACTCAGCACCAGCATCAC
                                                           率[Ccr，Ccr＝（Ucr×24 h尿量）/（Scr×1 440）]。
        1.3 动物
                                                           2.4 大鼠血清中肠源性尿毒素含量的检测
            本研究所用大鼠为 SPF 级雄性 Wistar 大鼠，体质量
                                                               取“2.2”项下采集的血清样本，采用超高效液相色
        为180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公
                                                           谱-电喷雾串联三重四极杆质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）
        司，动物生产合格证号为SCXK（京）2016-0006。动物饲
                                                           法同时测定大鼠血清中TMAO、硫酸吲哚酚（IS）、硫酸对
        养于天津市医药科学研究所动物房，动物使用许可证号
                                                           甲酚（PCS）的含量。色谱条件采用色谱柱为InertSustain
        为SYXK（津）2016-0007。所有操作均严格按照天津市医
                                                           C18 （100 mm×3.0 mm，3.0 µm）；柱温为 35 ℃；流动相为
        药科学研究所实验动物伦理相关规定进行，并经过伦理
                                                           乙腈-0.1％甲酸水溶液（25∶75，V/V）；流速为0.4 mL/min；
        委员会批准（批准文号IMPS-EAEP-Z-2018B1008-02）。
                                                           进样量为10 µL。质谱条件采用离子源为ESI，正负离子
        2 方法
                                                           模式；定量分析采用多重反应离子监测（MRM）；加热
        2.1 分组、造模与给药
                                                           模块温度为 400 ℃；DL 温度为 250 ℃；雾化气流速为
            55只大鼠适应性喂养7天后，随机取10只大鼠作为
                                                           3.0 L/min；干燥气流速为 15 L/min；离子源电压为 4.0
        假手术组（分离肾组织，但并不切除），剩余大鼠采用5/6
                                                           kV。TMAO、IS、PCS质谱分析条件见表2。
                [10]
        肾切除法 复制CRF模型大鼠。具体操作如下：大鼠先
                                                                    表2 TMAO、IS、PCS质谱分析条件
        行右侧 2/3 肾切除手术——术前 2 h 肌内注射青霉素钠
                                                               Tab 2 MS parameters of TMAO，IS and PCS
       （0.3 mL/只）预防感染，再腹腔注射戊巴比妥钠（45
                                                            条件             TMAO        IS          PCS
        mg/kg）麻醉后，剃去右侧肾区的毛发，并用碘伏-75％酒                       离子模式           ESI（+）      ESI（－）      ESI（－）
        精消毒，以手术刀切开皮肤，找出右肾，剥离肾膜；以止                           质荷比            76.10→57.95  212.10→80.00  186.90→107.05
                                                            Q1 Pre Bias，V  －28         21          11
        血钳夹住右肾的肾蒂，剪去右肾的上 1/3 和下 1/3，以电
                                                            碰撞能量，eV        －21         22          20
        凝器将切面有效止血，再用明胶海绵吸附止血后，将肾                            Q3 Pre Bias，V  －23         28          16
        平稳放回腹腔，逐层缝合。1 周后大鼠再行左肾全切                           2.5  大鼠回肠组织中 Occludin、ZO-1 mRNA 表达水平
        术——用 3-0 手术线结扎左肾肾蒂，切去左肾。各组大                        的检测
        鼠于第2次术后1周，进行眼眶取血，并测定血清中肌酐                              采用RT-PCR进行检测。按相关试剂（盒）说明书操
       （Scr）、尿素氮（BUN）含量，当两者水平较假手术组均升                       作，将“2.2”项下冻存的各组大鼠回肠组织用Trizol试剂
        高时，表明大鼠造模成功（本研究共剔除死亡和不成模                           提取总 RNA，并测定 RNA 浓度，然后将其稀释为 250
        大鼠5只）。将造模成功的大鼠随机分为模型组、尿毒清                          mg/L，进行逆转录，获得 cDNA。取 cDNA 1 μL 进行
        颗粒组（2.5 g/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得）和大                     PCR 扩增。PCR 反应体系（20 μL）包括：2×UltraSYBR
        黄-丹参药对高、低剂量组[6、3 g/kg（以生药量计），剂量                    Mixture 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，cDNA 1.6 μL，
        根据临床等效剂量的12、6倍换算而得]，每组10只。假                        ddH2O 6.8 μL。反应条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃
        手术组和模型组大鼠灌胃等体积水，给药组大鼠灌胃相                           变性 15 s，60 ℃ 退火 1 min，40 个循环。溶解条件为：
        应药物（以水作为溶剂，灌胃体积为 10 mL/kg），每天 1                    95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。 以
        次，连续12周。                                           GADPH 作为内参，采用 2        －ΔΔCt 法计算 Occludin、ZO-1 的
        2.2 标本采集                                           表达水平。实验重复4次。
            末次给药后，收集各组大鼠 24 h 尿液，以检测尿肌                     2.6  大鼠回肠组织中 Occludin、ZO-1 蛋白表达水平
        酐（Ucr）含量。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻                    检测
        醉后，于腹主动脉取血。血样静置 1～2 h 后，以 3 000                        采用免疫荧光法进行检测。将“2.2”项下 4％多聚
        r/min离心10 min，分离上层血清于－20 ℃冻存，以检测                   甲醛固定好的回肠组织脱水，石蜡包埋后切片（4 μm），
        相关生化指标。取血完成后，剖取各组大鼠肾组织，以                           用二甲苯和 100％、95％、85％、75％的乙醇溶液对切片
        4％多聚甲醛固定，用于苏木素-伊红（HE）染色和 Mas-                      进行脱蜡，再以微波炉加热进行抗原修复，冷却至室温


        中国药房    2021年第32卷第7期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 7  ·827 ·
   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70