Page 64 - 《中国药房》2021年第6期
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绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，           化物酶（HRP）标记山羊抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）抗体
        PMOP）是一种常发生于绝经后 5～10 年且以高度脆性                       （二抗）、逆转录试剂盒（批号GGSKCqwes7758、GGSKC-
        和结构破坏为特征的代谢性骨病 。PMOP的发生常归                           qwes8932、GGSKCqwes5524、GGSKCqwe7643、GGSKC-
                                     [1]
        因于绝经后的雌激素缺乏，由于雌激素对破骨细胞的抑                            qwes7365）均购自广州欧慕生物科技有限公司；其余试
        制作用减弱，骨吸收功能强于骨形成，造成骨重建失衡，                           剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。
        从而导致骨强度下降 。据估计，30％～50％的绝经后                          1.3 动物
                           [2]
        妇女患有这种疾病，且随着人口老龄化加剧，PMOP 的                              SPF 级成年 SD 大鼠 60 只，雌性，体质量 200～280
        卫生经济负担成倍增加，已成为一个重要的公共卫生问                            g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产
        题 [3－4] 。近年来发现，自噬与 PMOP 的发生发展密切相                    许可证号为 SCXK（粤）2019-0047。本研究方案通过广
        关：自噬是细胞通过溶酶体将受损的细胞器、错误折叠                            州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准。
        的蛋白质及其他大分子物质等降解并再利用的自我保                             2 方法
        护机制，可通过减轻氧化应激所致的细胞损伤来延缓、                            2.1 分组、造模与给药
        减轻骨量的丢失        [5－6] 。中药补骨脂具有补肾助阳壮骨等                    所有大鼠适用性喂养2周后，随机分为正常组、模型
        功效，其有效成分补骨脂素近年来多被临床报道用于治                            组、阳性对照组（0.09 mg/kg雌二醇 ）和补骨脂素低、中、
                                                                                         [9]
                     [7]
        疗骨质疏松症 。研究发现，激活的磷脂酰肌醇 3 激酶                          高剂量组（22、44、88 mg/kg，给药剂量根据前期预实验
        （PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白                      结果设置），每组10只。除正常组外，其余各组大鼠均采
        （mTOR）信号通路可促进细胞存活、生长和增殖，与雌激                         用卵巢摘除去势法建立 PMOP 模型 。首先将大鼠麻
                                                                                           [10]
        素通路有多处相交且有相互促进的作用，共同影响骨代                            醉（腹腔注射10％水合氯醛溶液），然后在其第4腰椎横
          [8]
        谢 。基于此，本文研究了补骨脂素对绝经后大鼠骨质                            突 0.5 cm 左右处纵深剖离约 1.2 cm，切除双侧卵巢，同
        疏松及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，旨在为阐明其                      时腹腔注射青霉素（每天10万单位，每天1次，连续3天）
        抗骨质疏松作用机制提供参考。                                      以预防感染。术后大鼠正常饲养2个月，正常组和模型
        1 材料                                                组大鼠灌胃等体积生理盐水，各药物组大鼠灌胃相应药
        1.1  主要仪器                                           液（均以生理盐水为溶剂），灌胃体积均为0.005 mL/g，每
            本研究所用主要仪器包括Ⅸ81 型透射电子显微镜                         天1次，连续给药98天。
        （德国Leica公司）、3K15型低温高速离心机（美国Sigma                    2.2  大鼠股骨、椎骨骨密度的检测
        公司）、ABI 7500 型实时荧光定量聚合酶链式反应                             末次给药24 h后，各组大鼠腹腔注射10％水合氯醛
        （PCR）仪（美国 ABI 公司）、AX-Ⅱ型凝胶成像仪（美国                     溶液麻醉，将其右股骨、椎骨部位放在双能 X 射线骨密
        Life Technology公司）、Dexa Pro-1型双能X射线骨密度              度仪上检测股骨、椎骨骨密度。
        仪（美国GE公司）和680型全自动酶标仪、PowerPac Ba-                   2.3  大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP 含量和 BMP2、
        sic型电泳仪、BT25S型天平（美国Bio-Rad公司）等。                     VEGF水平的检测
        1.2  主要药品与试剂                                            采用 ELISA 法进行检测。末次给药 2 h 后，于大鼠
            补骨脂素原料药（批号1202133231，纯度98％）购自                   腹主动脉取血 3 mL，放置 1.5 h 后，以 4 000 r/min 离心
        广东晶欣生物科技有限公司，戊酸雌二醇片（阳性对照，                           12 min，分离上层血清，严格按照试剂盒说明书进行操
        批号20198876，规格2 mg/片）购自廊坊高博京邦制药有                     作，使用酶标仪检测血清中钙离子、骨钙素、P1NP 含量
        限公司，10％水合氯醛（批号20191204）购自天津市大茂                      和BMP2、VEGF水平。
        化学试剂厂，青霉素注射液（批号 2019153651253，规格                    2.4  大鼠股骨组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达的
        160 万单位/支）购自河南省中农康畜贸易有限公司，血                         检测
        清钙离子、骨钙素、Ⅰ型前胶原 N 端前肽（P1NP）、骨形                           采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。大鼠取血后
        态发生蛋白 2（BMP2）、血管内皮生长因子（VEGF）酶联                      处死，取其左侧股骨洗净，取部分骨片，采用 Trizol 法提
        免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、Trizol试剂、RIPA蛋白裂                   取总RNA，按试剂盒说明书方法操作，将总RNA逆转录
        解 液（ 批 号 ZN2798450、ZN27841224、ZN27629852、           合成 cDNA，行 PCR 扩增。反应体系（共 20 µL）包括
        ZN27637841、ZN25725730、ZN13613654、ZN45845518）        cDNA 模板 4 μL，上、下游引物各 2 μL，SYBR 荧光染料
        均购自美国 Invitrogen 公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰                    10 μL，无核酸酶水 2 μL。反应条件为 94 ℃预变性 5
        胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、PCR 试剂盒、BCA 蛋                    min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min（共
        白含量检测试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、ECL                       40 个循环）。以 GAPDH 为内参，生成扩增曲线和熔解
        试剂盒（批号 HGEB45416、HGEB45518、HGEB48760、               曲线，使用 Image J v1.5.1 软件分析并采用 2        －ΔΔCt 法计算
        HGEB76375、HGEB98421）均购自美国Sigma公司，山羊                 PI3K、Akt、mTOR mRNA 的 表 达 水 平 。 PI3K、Akt、
        抗大鼠PI3K、Akt、mTOR多克隆抗体（一抗）和辣根过氧                      mTOR的引物序列及产物长度见表1。


        ·698 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 6                                    中国药房    2021年第32卷第6期
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