Page 69 - 《中国药房》2021年第6期
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皮肤成纤维细胞是创面愈合修复的重要结构细胞，                         抗体、大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、
        其增殖、凋亡、迁移、炎症反应均参与创面修复过程，并                          大鼠β-微管蛋白（β-tubulin）单克隆抗体、山羊抗兔免疫
        与毛细血管共同构成肉芽组织结构 。因此，调控该类                           球蛋白 G（IgG）（H+L）Fluor 488 结合多克隆二抗、山羊
                                       [1]
        细胞的生物学行为，对创面愈合具有重要意义。                              抗大鼠 IgG（H+L）Fluor 647 结合多克隆二抗（批号
            湿润烧伤膏适用于烧伤、慢性难愈合皮肤溃疡等创                         AF7014、DF6087、T0004、T0023、S0018、S0014）均购自
                                   [2]
        面的修复，且临床使用疗效明显 。已有研究证实，湿润                          美国 Affinity 公司，IRDye 800CW 山羊抗兔二抗、IRDye
        烧伤膏可明显改善表皮生长细胞超微结构、稳定细胞内                           680RD 山羊抗鼠二抗（批号 925-32211、925-68070）均购
        环境、增强成纤维生长因子（bFGF）和血管生长因子                          自美国 LI-COR 公司，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）
       （VEGF）的增殖分化能力，促进创面修复                [3－4] 。目前，关     染料、抗荧光衰减封片剂、Triton X-100 试剂和 4％组织
        于湿润烧伤膏的研究主要集中于在体创面愈合，有关其                           细胞固定液（批号 C0065、S2100、T8200、P1110）均购自
        作用机制尚不十分明确。已有研究报道，抑制同源性磷                           北京索莱宝科技有限公司，RIPA 裂解液（强）（批号
        酸酶张力蛋白（PTEN）的表达可增加内皮细胞分裂和迁                         P0013B）购自上海碧云天生物技术有限公司，其余试剂
                                [5]
        移，促进角膜内皮伤口愈合 。核因子κB（NF-κB）是炎                       均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。
        症和氧化应激的生物标志物，参与创面愈合的炎症反应                           1.3 细胞
                        [6]
        及细胞增殖等活动 。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激                           大鼠皮肤成纤维细胞购自上海中乔新舟生物科技
        酶B（Akt）通路可调控细胞生长、增殖、能量代谢，并可改                       有限公司。
        变细胞结构 。本课题组前期研究发现，湿润烧伤膏可                           2 方法
                  [7]
                               [8]
        促进大鼠成纤维细胞增殖 。基于此，本研究通过构建                           2.1 细胞培养
        炎性损伤大鼠皮肤成纤维细胞模型，研究湿润烧伤膏对                               取大鼠皮肤成纤维细胞适量，接种于完全培养基
        模型细胞存活、迁移、炎性因子分泌情况的影响，并基于                          （含 10％胎牛血清的 DMEM 培养基）中，于 37 ℃、5％
        PTEN/NF-κB、PI3K/Akt 信号通路初步研究其可能的作                  CO2下培养（培养条件下同）。每 2 天更换 1 次新的完全
        用机制，旨在为完善湿润烧伤膏促创面愈合的分子机制                           培养基，待细胞生长至对数生长期（即融合度达 80％～
        提供参考。                                              90％）时传代。
        1 材料                                               2.2  药液的制备
        1.1  主要仪器                                          2.2.1  湿润烧伤膏药液         取湿润烧伤膏适量，用无水乙
            本研究所用主要仪器包括 TriStar LB941 型酶标仪                 醇-二甲基亚砜溶液（1 ∶ 1，V/V）溶解，制成质量浓度为
       （德国Berthold公司）、FV3000型激光扫描共聚焦显微镜                    0.1 g/mL（以膏体质量计）的溶液，于－4 ℃密封保存，使
       （日本 Olympus 公司）、PoverPac 3000 型电泳仪（美国               用时用完全培养基稀释至0.6 mg/mL。
        Bio-Rad公司）、Odyssey型双色红外激光成像系统（美国                   2.2.2  阳性对照药液        将康复新液置于－4 ℃密封保
        LI-COR公司）等。                                        存，使用时用完全培养基稀释至1.25％。
        1.2  主要药品与试剂                                       2.3  细胞存活率检测
            湿润烧伤膏（批号 Z20000004，每 1 g 相当于饮片                     采用 CKK-8 法进行检测。取对数生长期细胞接种
        0.21 g）购自汕头市美宝制药有限公司，康复新液（阳性                       于 96 孔板中，接种密度为 5×10 个/孔。培养 24 h 后，将
                                                                                      3
        对照，批号M190550，每瓶100 mL）购自湖南科伦制药有                    其随机分为对照组、脂多糖组（5 μg/mL ）、康复新液组
                                                                                             [9]
        限公司，CCK-8 试剂（批号 M4839）购自美国 AbMole 公                （5 μg/mL 脂多糖+1.25％康复新液 ）和湿润烧伤膏组
                                                                                         [10]
                                                                                              [8]
        司 ，胰 蛋 白 酶 、DMEM 培 养 基（批 号 25200-056、              （5 μg/mL脂多糖+0.6 mg/mL湿润烧伤膏 ），每组设置6
        C11995500BT）均购自美国Gibco公司，胎牛血清（批号：                  个复孔，同时设置不含细胞的空白孔。对照组加入完全
        ABS972）购自上海爱必信生物科技有限公司，BCA蛋白                       培养基，脂多糖组加入含5 μg/mL脂多糖的完全培养基，
        定量试剂盒、无蛋白快速封闭液（5×）（批号 ZJ101、                       给药组加入含5 μg/mL脂多糖和相应浓度药液的完全培
        PS108）均购自上海雅酶生物医药科技有限公司，肿瘤坏                        养基。培养 48 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，37 ℃
        死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、                     孵育 1 h，使用酶标仪于 450 nm 波长处测定各孔的光密
        IL-6 ELISA 试剂盒（批号 CSB-E04741m、E-EL-R0015C）         度（OD）值并计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝（检测
        均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，脂多糖                            组 OD 值－空白孔 OD 值）/（对照组 OD 值－空白孔 OD
       （批号 L2880，纯度≥99％）购自美国 Sigma 公司，兔                    值）×100％。试验重复3次。
        PTEN单克隆抗体、兔Akt多克隆抗体、兔PI3K单克隆抗                      2.4 细胞迁移率检测
        体（批号 ab32199、ab8805、ab180967）均购自美国 Abcam               采用细胞划痕试验进行检测。取对数生长期细胞
                                                                                         5
        公司，兔磷酸化 p65（p-p65）多克隆抗体（批号 3033s）购                 接种于6孔板中，接种密度为1×10 个/孔。培养48 h后，
        自美国 CST 公司，兔 TNF-α多克隆抗体、兔 IL-6 多克隆                 使用10 μL枪头垂直于孔板划痕，弃细胞上清液，用磷酸


        中国药房    2021年第32卷第6期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 6  ·703 ·
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