Page 43 - 《中国药房》2021年第4期
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计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝检测组OD值/空白                         L4期N2线虫到实验NGM平板上，每组800条，于20 ℃
        对照组OD值×100％。试验重复3次。                                恒温培养箱中培养 3 d 后，分别收集各组线虫，加入
        2.8 AM 对 293T 细胞中 Nrf2-ARE 荧光素酶活性的                 Trizol 试剂匀浆后提取线虫总 RNA，逆转录及荧光定量
        影响                                                 PCR 操作同“2.9”项。以 PMP-3 作为内参，按“2.9”项下
            将 293T 细胞以 4×10 个/孔的密度接种于 96 孔板                方 法 分 析 目 标 基 因 GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、
                              4
        中，按“2.7”项下方法分组（不设模型组），每组设 6 个复                     HSP-16.2、SOD-3 mRNA 的相对表达量。试验重复 3
        孔。待细胞融合至 80％时，每孔均瞬时转染 Nrf2-ARE                     次。N2线虫中SKN-1下游靶基因的引物序列及产物片
        质粒100 ng，并于转染6 h后更换完全培养基；继续培养                      段长度见表2。
        18 h，弃去培养基，加入与“2.7”项下相同的含药完全培                      表 2 N2 线虫中 SKN-1 下游抗氧化基因的引物序列及
        养基100 μL，培养24 h；另外AM中剂量组分别培养12、                          产物片段长度
        18、24 h，采用荧光素酶报告基因法测定 Nrf2-ARE 荧光                  Tab 2 Primer sequences and fragment length of
        素酶活性。具体操作如下：弃培养基，加入报告基因裂
                                                                   SKN-1 downstream antioxidant genes in N2
        解液100 μL，室温振摇30 min，每孔转移裂解物30 μL到
                                                                   nematode
        96孔全白微孔板中，随后加入荧光素酶检测试剂50 μL，
                                                           基因                引物序列（5′→3′）           产物片段长度，bp
        立即使用多功能酶标仪检测各孔的化学发光值并计算                            PMP-3        上游：TGGCCGGATGATGGTGTCGC       190
        Nrf2-ARE 荧光素酶相对活性：相对活性＝检测组化学                                    下游：ACGAACAATGCCAAAGGCCAGC
        发光值/空白对照组化学发光值。试验重复3次。                             GCS-1        上游：AGGTGAATGCGATGCTTGGA       105
                                                                        下游：CGATGAGACCTCCGTAAGGC
        2.9 AM 对 N2a 细胞中 Nrf2 下游抗氧化基因表达的                   GST-7        上游：GGGAGGAGGCTCAAGTCAAC       184
        影响                                                              下游：CCAGCCGACTTGAGGAAGTT
                                                           GST-10       上游：TCGAAGACATTCGGTTCGACT      182
                             5
            将 N2a 细胞以 4×10 个/孔的密度接种于 6 孔板中，
                                                                        下游：GAAGGTTGCCTCTTGCTCGT
        按“2.8”项下方法进行细胞分组、给药，每组设 6 个复                       HSP-60       上游：CCAAGGACGTCAAGTTCGGA       141
        孔。培养 24 h 后，采用 Trizol 法提取细胞总 RNA，按照                             下游：TGATCTTTGGGCTTCCCCAC
                                                           HSP-16.2     上游：CTCAACGTTCCGTTTTTGGTG      199
        BeyoRT TM  Ⅲ First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试
                                                                        下游：TGGATTGATAGCGTACGACC
        剂盒说明书逆转录得 cDNA，使用 Power Up             TM  SYBR TM  SOD-3       上游：TCTACTGCTCGCACTGCTTC       79
        Green Master Mix试剂盒以实时荧光定量PCR仪进行扩                               下游：CTGGGAGAGTGTGCTTGGAG
        增。反应体系（共 10 μL）：cDNA 模板 4 μL，SYBR             TM   2.11  统计学方法
        Green Mix试剂5 μL，上、下游引物各0.5 μL。反应条件：                    采用 GraphPad Prism 6.0 软件对数据进行统计分
        50 ℃加热 2 min，95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15 s，            析。数据以 x±SEM 表示，组间比较采用单因素方差分
        60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以甘油              析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，采用2              －ΔΔCt 法分析    3 结果
        目标基因HO-1、NQO-1 mRNA的表达水平，以空白对照                     3.1  AM对N2线虫寿命的影响
        组为标准计算相对表达量。试验重复3次。N2a细胞中                              空白对照组、阳性对照组和AM低、中、高剂量组N2
        Nrf2 下游抗氧化基因的引物序列及产物片段长度见                          线虫的平均存活时间分别为（10.781±2.077）、（11.883±
        表1。                                                3.211）、（11.819±3.033）、（12.634±3.341）、（14.453±
        表1 N2a细胞中Nrf2下游抗氧化基因的引物序列及产                        3.163）d（n＝3）。与空白对照组比较，阳性对照组和AM
             物片段长度                                         各剂量组N2线虫的平均存活时间均显著延长（P＜0.05
        Tab 1  Primer sequences and fragment length of Nrf2
                                                           或P＜0.01）。
               downstream antioxidant genes in N2a cell
                                                           3.2 AM对氧化应激下N2线虫寿命的影响
        基因               引物序列（5′→3′）           产物片段长度，bp       空白对照组、阳性对照组和AM低、中、高剂量组N2
        GAPDH        上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA       77
                     下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT             线虫在氧化应激下的平均存活时间分别为（6.238±
        HO-1         上游：AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA     100      2.161）、（7.061 ± 2.359）、（7.429 ± 2.284）、（7.764 ±
                     下游：GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA
        NQO-1        上游：AGGATGGGAGGTACTCGAATC     127      2.659）、（7.709±2.572）h（n＝3）。与空白对照组比较，
                     下游：TGCTAGAGATGACTCGGAAGG              除阳性对照组外，AM各剂量组N2线虫在氧化应激下的
        2.10  AM 对 N2 线虫中 SKN-1 下游抗氧化基因表达的                 平均存活时间均显著延长（P＜0.05或P＜0.01）。
        影响                                                 3.3 AM对N2线虫繁殖能力的影响
            按“2.4”项下方法分组、制备实验 NGM 平板，挑取                        与空白对照组比较，阳性对照组和 AM 低、中剂量


        中国药房    2021年第32卷第4期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 4  ·421 ·
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