Page 42 - 《中国药房》2021年第4期
P. 42

线虫”）和尿嘧啶缺陷型大肠埃希菌 OP50（Escherichia                   黄素，剂量参考文献[12]和预实验结果设置）和 AM 低、
        Coli OP50）均购自美国秀丽隐杆线虫遗传中心（Cae-                      中、高剂量组（100、200、300 μg/mL，以提取物计，剂量设
        norhabditis Genetics Center）。                       置参考预实验结果设置，下同）。用M9溶液将姜黄素和
        1.4 细胞与质粒                                           AM 贮备液稀释至实验所需终浓度，于每个 NGM 固体
            小鼠神经瘤母细胞 N2a 和人胚肾细胞 293T 均购自                    培养基中加入相应药液 500 μL，待药液完全渗透后，再
        美国 ATCC 细胞库，Nrf2-ARE 质粒购自美国 Promega                 加入E.coli OP50菌液（以LB液体培养基为溶剂）100 μL，
        公司。                                                 空白对照组加入等体积 M9 溶液和 E.coli OP50 菌液，
        2 方法                                                37 ℃培养过夜，即实验NGM平板制备完成。将同期化
        2.1 溶液的制备                                           的L4期N2线虫转移至各组实验NGM平板上，每组100
        2.1.1 M9 溶 液     准 确 称 取 Na2HPO4·12H2O 15.0 g、      条，于20 ℃恒温培养箱中培养。从N2线虫进入产卵期
        KH2PO4 3.0 g、NaCl 5.0 g、MgSO4 0.12 g，用水 800 mL 溶    起，每 24 h 转至 1 个新的实验 NGM 平板上（简称为“转
        解后再定容至 1 000 mL，混匀，121 ℃高压蒸汽灭菌 30                   板”），至不再产卵时改为隔日转板1次。每日定时用体
        min，即得。                                             式显微镜观察，统计每组N2线虫的个体死亡数量，直至
        2.1.2 AM 溶液     采取冷浸法制备 AM 。称取白术饮                   N2 线虫全部死亡（以线虫个体对机械性刺激无反应视
                                          [11]
        片 2 kg，用 2 倍量（L/kg）的 95％乙醇浸渍，浸渍 3 次，每               为死亡），计算各组线虫的平均存活时间。剔除标准：
        次 1 周；浸提液滤过后合并，减压浓缩得到 AM 浸膏 359                    （1）爬至平板壁或盖上而干死；（2）线虫死亡后虫卵在体
        g（得率为 18％）。将上述浸膏置于 4 ℃冷藏，备用。使                       内孵化；（3）钻入琼脂中。实验重复3次。
        用前，将白术浸膏溶于DMSO 1 mL中，制成质量浓度为
                                                            2.5 AM对氧化应激下N2线虫寿命的影响
        300 mg/mL（以提取物量计）的AM贮备液，经0.22 μm滤
                                                                参考文献[13]方法并稍作修改进行实验。按“2.4”
        膜滤过除菌，于－20 ℃保存；后续试验时以M9溶液（用
                                                            项下方法分组、制备实验 NGM 平板并加入 N2 线虫，于
        于线虫实验，下同）或含10％胎牛血清、1％青-链霉素混
                                                            20 ℃恒温培养箱中培养 3 d 后，转移各组 N2 线虫至含
        合液的DMEM高糖培养基（后文简称为“完全培养基”，
                                                            40 mmol/L H2O2的24孔板中模拟氧化应激状态，每孔15
        用于细胞试验，下同）将其稀释至所需浓度即可（体系中
                                                            条，每组 60 条，使用体式显微镜观察，计数每小时 N2 线
        DMSO终浓度＜1‰）。
                                                            虫的个体死亡数量，直至N2线虫全部死亡，计算各组线
        2.1.3  阳性对照溶液         精密称取姜黄素对照品 36.84
                                                            虫的平均存活时间。死亡标准和剔除标准同“2.4”项。
        mg，溶于 DMSO 1 mL 中，制成浓度为 100 mmol/L 的贮
                                                            实验重复3次。
        备液，经0.22 μm滤膜滤过除菌，于－20 ℃保存；后续试
                                                            2.6  AM对N2线虫繁殖能力的影响
        验时以M9溶液或完全培养基将其稀释至所需浓度即可
                                                                参考文献[14]方法进行实验。按“2.4”项下方法分
        （体系中DMSO终浓度＜1‰）。
                                                            组、制备实验NGM平板并加入N2线虫，于20 ℃恒温培
        2.1.4 NGM 固体培养基         称取 NaCl 0.6 g、琼脂粉 3.4
                                                            养箱中培养，此时记为生殖实验第 1 天；每日转板 1 次，
        g、胰蛋白胨 0.5 g，加水 195 mL，摇匀，121 ℃高压灭菌
                                                            直至N2线虫丧失生殖能力（以N2线虫转移至新的实验
        30 min；冷却至约55 ℃时，再依次加入1 mol/L的MgSO4
                                                            NGM 平板中，24 h 内未见新卵视为其丧失生殖能力）。
        溶液 0.2 mL、5 mg/mL 的胆固醇溶液 0.2 mL、1 mol/L 的
        CaCl2 溶液 0.2 mL、用 0.22 μm 滤膜滤过除菌的 1 mol/L           20 ℃下孵育产卵板，孵化后，使用体式显微镜观察并记
        的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）5 mL，混匀后倒入无菌的培养                      录子代数量，以子代数量反映繁殖能力。实验重复3次。
        皿中，每板10 mL，晾干，密封置于4 ℃冰箱中，备用。                        2.7  AM对氧化应激下N2a细胞存活率的影响
                                                                                                      4
        2.2 N2线虫培养与同期化处理                                        采用 MTT 法进行检测。将 N2a 细胞以 2×10 个/孔
            将 N2 线虫接种于已涂布 E.coli OP50 的 NGM 固体              的密度接种于 96 孔板中，于 37 ℃、5％CO2培养箱中培
        培养基中，20 ℃恒温培养，及时观察其生长状态并传                           养24 h后，将其随机分为空白对照组、模型组、阳性对照
        代。转移生殖期的 N2 线虫到新的 NGM 固体培养基上                        组（100 µmol/L 姜黄素）和 AM 低、中、高剂量组（100、
        产卵 2 h 进行同期化处理，并将同期化后的 L4 期 N2 线                    200、300 μg/mL），每组设 6 个复孔。用完全培养基将姜
        虫用于实验。                                              黄素和AM贮备液稀释至所需终浓度，各给药组加入含
        2.3 细胞培养                                            相应药物的完全培养基100 μL，空白对照组加入等体积
            将N2a细胞和293T细胞均接种于完全培养基中，于                       完全培养基。培养 2 h 后，除空白对照组外的其余各组
        37 ℃、5％CO2培养箱中培养，隔日换液，待细胞处于对                        均加入H2O2 （终浓度为700 µmol/L）复制氧化应激模型，
        数生长期时接种于不同培养板中，用于试验。                                继续培养22 h；加入5 mg/mL MTT溶液20 µL，培养4 h，
        2.4  AM对N2线虫寿命的影响                                   弃去培养基；每孔加DMSO 150 μL，摇床振摇10 min，使
            实验设置空白对照组、阳性对照组（100 μmol/L 姜                    用全波长酶标仪于490 nm波长处测定光密度（OD）值并


        ·420 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 4                                    中国药房    2021年第32卷第4期
   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47