Page 75 - 《中国药房》2021年2期

5.0、1.5、0.5、0.15、0.05 μmol/L的溶液。 干，残渣用甲醇200 μL复溶，再次离心10 min，取上清液
2.2 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）辅 适量，对乙酰氨基酚等代谢产物进行UPLC-MS/MS分析。
酶溶液的制备 2.7.2 色 谱 与 质 谱 条 件 （1）色 谱 条 件 ：以 Acquity
UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.8 μm）为色谱柱，流
®
参照文献[14]方法，依次称取 NADP-Na2、G-6-P-Na2
和氯化镁 200、200、133 mg，用水溶解并定容至 10 mL， 动相为 0.01％甲酸水溶液-0.01％甲酸乙腈为流动相进
置于－20 ℃下保存备用，记为A液。依次称取柠檬酸钠 行梯度洗脱（洗脱程序见表1），柱温为40 ℃，流速为0.4
和G-6-P-DH 44 mg、1 000 U，用水溶解并定容至25 mL， mL/min，进样量为2 μL。（2）质谱条件：以电喷雾电离源
置于－20 ℃下保存备用，记为 B 液。使用时，将 A 液和 （ESI）为离子源，扫描模式为多反应监测（MRM）模式，
B液按体积比5∶1混匀后，加至孵育体系中。 扫描方式为正、负离子，数据采集范围为m/z 100～1 200，
2.3 混合探针药物溶液的制备 毛细管电压为 2.0 kV（正离子模式）、1.5 kV（负离子模
参照文献[15]方法，精密称取非那西丁、右美沙芬、 式），离子源温度为120 ℃（正离子模式）、110 ℃（负离子
奥 美 拉 唑 、睾 酮 、甲 苯 磺 丁 脲（分 别 为 CYP1A2、 模式），脱溶剂的温度为400 ℃（正离子模式）、450 ℃（负
CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9 的探针药物）对 离子模式），碰撞气为氩气，雾化气为氮气，锥孔气流量
照品 7.557、12.3、4.32、7.21、13.5 mg，用甲醇溶解并定容 为50 L/h，脱溶剂气流量为800 L/h，5个探针药物代谢产
至10 mL，作为探针药物贮备液。临用前，精密吸取上述 物及内标的质谱监测参数见表 2。采用甲酸钠（0.5
探针药物贮备液各1 mL，用氮气流吹干，残渣加入二甲 mmol/L）和亮氨酸脑啡肽（1 ng/mL）分别进行质量轴的
基亚砜（DMSO）20 μL和甲醇80 μL溶解，最后用PBS定 校正和质量的实时校正。
容至5 mL，制备成非那西丁、右美沙芬、奥美拉唑、睾酮、 表1 UPLC-MS/MS法的流动相梯度洗脱程序
甲苯磺丁脲质量浓度分别为1 000、1 500、250、500、1 000 Tab 1 Gradient elution procedure of mobile phase of
μmol/L的混合探针药物溶液。 UPLC-MS/MS method
2.4 特异性抑制剂溶液的制备 时间，min 0.01％甲酸水溶液，％ 0.01％甲酸乙腈，％
分别精密称取溶液α-萘黄酮、奎尼丁、（+）-N-3-苄基 0 95 5
香酚、酮康唑、磺胺苯吡唑（分别为 CYP1A2、CYP2D6、 0.5 95 5
2 2 98
CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9 的特异性抑制剂）对照品 4 2 98
适量，用甲醇溶解、稀释，制成质量浓度均为1 mg/mL的 5 95 5
单一贮备液。临用时，用甲醇稀释上述单一贮备液，配 表2 5个探针药物代谢产物及内标的质谱监测参数
制成质量浓度分别为 0.136、0.162、0.088、0.266、0.157 Tab 2 Mass monitoring parameters of metabolites
mg/mL的溶液，备用。 and internal standard of five probe drugs
2.5 代谢产物标准溶液的制备 代谢产物/内标 探针药物 CYP酶亚型 扫描模式 母离子m/z 子离子m/z 碰撞能，eV
分别精密称取适量对乙酰氨基酚、右啡烷、5-羟基 对乙酰氨基酚 非那西丁 CYP1A2 正离子 152.0 110.0 15
奥美拉唑、6β-羟基睾酮、羟基甲苯磺丁脲（分别为非那 右啡烷 右美沙芬 CYP2D6 正离子 258.4 199.0 25
5-羟基奥美拉唑 奥美拉唑 CYP2C19 正离子 362.2 214.1 15
西丁、右美沙芬、奥美拉唑、睾酮、甲苯磺丁脲的代谢物） 6β-羟基睾酮 睾酮 CYP3A4 正离子 305.3 269.3 15
等 5 种对照品，用甲醇溶解、稀释，制成质量浓度均为 1 羟基甲苯磺丁脲 甲苯磺丁脲 CYP2C9 负离子 285.0 186.0 15
mg/mL的单一贮备液。临用时，用甲醇将上述单一贮备 葛根素 正离子 417.0 267.0 30
液稀释至相应质量浓度，备用。 2.7.3 专属性考察 取肝微粒体孵育液，除不加探针药
2.6 肝微粒体体外孵育体系的建立 物和内标外，其余按“2.6”“2.7.1”项下方法处理后，再按
参照文献[16]方法，取人肝微粒体适量，用PBS稀释 “2.7.2”项下色谱和质谱条件进样测定，记录色谱图；将
至 0.5 g/L。于冰浴条件下，依次加入人肝微粒体溶液 “2.5”项下的代谢产物标准溶液加入至灭活的肝微粒体
20 μL、PBS 110 μL、相应浓度的树豆酮酸A或特异性抑 孵育液中，按“2.6”“2.7.1”项下方法处理后，同法进样测
制剂溶液 20 μL、NADPH 辅酶溶液（A 液 25 μL+B 液 5 定，记录色谱图；取“2.6”项下肝微粒体孵育液（5.0 μmol/L
μL）30 μL，于 37 ℃水浴中孵育 3 min；加入混合探针药 的树豆酮酸A），按“2.7.1”项下方法处理后，同法进样测
物溶液20 μL开始反应，反应时间为60 min。每浓度平行 定，记录色谱图。结果，空白肝微粒体对对乙酰氨基酚、
3份。试验过程中，确保孵育体系总体积为200 μL（PBS 右啡烷、5-羟基奥美拉唑、6β-羟基睾酮、羟基甲苯磺丁脲
浓度100 mmol/L），其中溶解探针药物的DMSO含量不超 和内标的测定无干扰，专属性良好，详见图2。
[17]
过0.1％，甲醇含量不超过1％ 。 2.7.4 线性关系考察 分别吸取对乙酰氨基酚、右啡
2.7 UPLC-MS/MS法的建立 烷、5-羟基奥美拉唑、6β-羟基睾酮、羟基甲苯磺丁脲单一
2.7.1 样品处理 于体外孵育体系中加入冰乙腈（含 贮备液适量，用甲醇稀释，配制成对乙酰氨基酚质量浓
0.4 mg/mL 葛根素）200 μL 终止反应，涡旋 60 s 后，以 度分别为0.26、0.52、1.04、2.09、4.18、8.35 μmol/L，右啡烷
13 000 r/min（下同）离心 10 min，取上清液，用氮气流吹 分别为0.36、1.44、4.32、8.64、17.28、34.56 μmol/L，5-羟基

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