Page 45 - 《中国药房》2020年22期
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置显微镜（日本 Nikon 公司）；ChemiDoc XRS+型全自动                剂量组小鼠分别灌胃相应药物（SA 和水飞蓟素均以
        化学发光凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。                        0.5％CMC-Na 生理盐水溶液为溶剂，分别配制成 5、2
        1.2 药品与试剂                                          mg/mL的混悬液后给药；给药剂量参考相关文献并按动
            SA 对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：                       物剂量换算而得        [14-16] ），灌胃体积均为20 mL/kg（其中SA
        MUST-17022401，纯度：97％）；水飞蓟素对照品（阳性药                  低剂量组用生理盐水补足灌胃体积至 20 mL/kg）；空白
        物，宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号：HG1144W1，                       对照组和模型组小鼠灌胃等体积 0.5％CMC-Na 生理盐
        纯度：98％）；TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附测定法                  水溶液。各组小鼠均每天给药1次，连续给药6周。
       （ELISA）检测试剂盒和 BCA 蛋白提取及浓度测定试剂                       2.3 小鼠血清中肝损伤指标水平检测
        盒（北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ，批 号 ：SEKM-0034、               末次灌胃给药 24 h 后，于小鼠眼眶取血并制备血
        SEKM-0007、SEKM-0002、PC0020）；丙 氨 酸 转 氨 酶            清。取部分血清样品，严格按相应试剂盒说明书操作，
       （ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）检测试剂盒（南京建成生                       按紫外分光光度法采用酶标分析仪检测血清中 AST 和
        物工程研究所，批号：C010-2-1、C009-2-1）；兔源NLRP3、              ALT的水平。
        凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、                  2.4 小鼠血清中炎症因子含量检测
        IL-1β、NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65（p-NF-κB p65）、            取“2.3”项下小鼠血清样品，严格按照相应 ELISA
        NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、TGF-β 1、          检测试剂盒说明书操作，以多功能酶标仪检测血清中
        Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶                TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。
       （GAPDH）多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊                          2.5 小鼠肝组织病理学检查
        抗兔 IgG 二抗（美国 Cell Signaling Technology 公司，批            小鼠取血完毕后，给予戊巴比妥麻醉并处死，立即
        号 ：13158、67824、24232、12703、59674、8214、4812、        取出肝脏，在 4％中性甲醛溶液中固定过夜，脱水，石蜡
        8219、3709、9513、9520、5174、4414）；高敏型ECL化学发           包埋，切片（4 μm）后进行HE染色，置于倒置显微镜下观
        光检测试剂盒（南京唯诺赞生物科技股份有限公司，批                           察并拍照。
        号：E412-02）；RIPA 裂解液（碧云天生物技术有限公司，                   2.6  小鼠肝组织中NLRP3/NF-κB及TGF-β/Smad信号
        批号：P0013B）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、苏木精-伊                   通路蛋白表达水平检测
        红（HE）染色试剂及聚丙烯酰胺凝胶等其余试剂均购自                              采用 Western blottting 法进行检测。取“2.5”项下肝
        上海阿拉丁试剂公司，实验用水为三级水。                                组织适量，用含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液在冰上
        1.3  动物                                            充分裂解，提取总蛋白，并采用 BCA 法测定蛋白含量。
            50 只雄性 ICR 小鼠，8～12 周龄，体质量 18～22 g，             取蛋白样本50 μg，变性处理后，采用12％聚丙烯酰胺凝
        购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物生产许可                          胶电泳，并转至聚偏氟乙烯薄膜上，于4 ℃下用5％脱脂
        证号：SCXK（沪）2020-0006]。所有动物于室温（22±                   牛奶封闭 2 h；然后加入 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、
        1）℃、空气湿度40％～50％、昼夜交替时间12 h/12 h条                   NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、TGF-β 1、Smad3、
        件下，以普通饲料喂养并自由饮水。                                   p-Smad3 抗体（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育过夜；
        2 方法                                               用TBST缓冲液洗膜，加入二抗（稀释度为1 ∶ 10 000），室
        2.1  造模                                            温孵育2 h；用TBST缓冲液洗膜，加入ELC发光液后，在
                                [12]
            采用经典的CCl4诱导法 建立小鼠肝纤维化模型：                       全自动化学发光凝胶成像分析系统中曝光显影。采用
        将 CCl4与橄榄油按体积比 1 ∶ 1 配制成油溶液后进行小                    Image J 1.8.0软件对目的蛋白条带进行分析，以GAPDH
        鼠皮下注射，注射体积为 3 mL/kg，每周 2 次（间隔 3 d），                为内参，以各目标条带与内参的灰度值比值表示其蛋白
        连续注射 6 周。空白对照组小鼠同法注射等体积橄榄                          表达水平，以 p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα、
        油。肝纤维化模型复制成功的评判标准 ：基本体征方                           p-Smad/Smad3灰度值比值表示相应蛋白的磷酸化水平。
                                           [13]
        面表现为活动减少、反应迟钝，毛色粗糙、灰暗、无光泽；                         2.7 统计学方法
        生化指标方面表现为血清中肝损伤指标AST、ALT水平                             采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资
        以及血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显升高；病                   料 均 以 x ± s 表 示 ，组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析
        理学变化方面表现为肝小叶结构破坏，有炎性细胞浸                            （One-way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。
        润，并出现大量纤维增生。                                       3 结果
        2.2 分组与给药                                          3.1 SA 对肝纤维化模型小鼠血清肝损伤指标水平的
            将小鼠随机分为空白对照组、模型组、水飞蓟素组                         影响
       （100 mg/kg）和 SA 低、高剂量组（20、40 mg/kg），每组 10               与空白对照组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST
        只。按“2.1”项下方法分别注射橄榄油或 CCl4油溶液建                      水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，水飞蓟素组
        立模型。末次皮下注射24 h后，水飞蓟素组和SA低、高                        和 SA 低、高剂量组小鼠血清中 ALT 和 AST 水平均显著


        中国药房    2020年第31卷第22期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22  ·2727 ·
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