Page 41 - 《中国药房》2020年22期
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的相对分子质量为399 316，约为399 kDa。
                                                               结合“2.3.1”～“2.3.4”及上述结果，确定γ-PGA-AMP
                                                           已成功合成。
                                                           2.4 蛇葡萄素的含量测定
                                                               将合成产物γ-PGA-AMP溶解在0.5 mol/L碳酸氢钠
                                                           溶液中得到其钠盐。用透析袋对该钠盐的水溶液进行
                                                           渗析，以去除分子量小的杂质和剩余的碳酸氢钠，达到
                                                           初步纯化的目的。将渗析物冷冻干燥，得到白色粉末，
                                                           采用紫外吸收光谱法检测其中蛇葡萄素的含量。结果，
                                                           蛇葡萄素的检测波长为293 nm，检测质量浓度的线性范
                                                           围为 2～200 μg/mL（r＝0.999 7，n＝6），平均回收率为
        10.0  9.0  8.0  7.0  6.0  5.0  4.0  3.0  2.0  1.0  0
                            化学位移，ppm                       99.07％（RSD＝0.78％，n＝6）；精密度、重复性、稳定性
                           A. γ-PGA-AMP
                                                           试验的 RSD 均小于 1.0％；合成产物中蛇葡萄素的含量
                                                           为32.3％（标准曲线法）。
                                                           2.5 γ-PGA-AMP的体外抗肿瘤活性评价
                                                               采用MTT法检测γ-PGA-AMP对肿瘤细胞的体外抑
                                                           制作用。MCF-7、HepG2、A549 细胞均采用含 10％胎牛
                                                           血清、1％青-链霉素双抗的 RPMI-1640 培养基（以下简
                                                           称“完全培养基”）复苏培养。细胞传代两次后，取对数
                                                           生长期的细胞接种于96孔培养板中，每孔细胞密度约为
                                                           5×10 个，置于37 ℃、5％CO2培养箱中过夜培养。3种肿
                                                                3
                                                           瘤细胞均随机分为溶剂对照组、5-FU组（阳性对照）、蛇
                                                           葡萄素组和γ-PGA-AMP 组。除溶剂对照组只加入完全
        11.0  10.0  9.0  8.0  7.0  6.0  5.0  4.0  3.0  2.0  1.0  0
                            化学位移，ppm                       培养基外，后3组均加入含相应药物的完全培养基，药物
                            B.蛇葡萄素                         终质量浓度分别均为 200、100、50、25、12.5 μg/mL（给药
            图4    γ-PGA-AMP和蛇葡萄素的 H-NMR图
                                         1
                                                           浓度参照课题组前期预试验结果设置），另外设空白对
        Fig 4  1 H-NMR spectra of γ-PGA-AMP and ampelopsin
                                                           照组（只加入完全培养基200 μL，不加细胞），每组设3个
        2.5 ppm 处的信号峰为溶剂 DMSO 上的氢。合成产物
                                                           复孔。将各组细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养24 h
        γ-PGA-AMP 的 波 谱 数 据 —— H-NMR（DMSO-d6，500
                                   1
                                                           后，每孔加入含 5 mg/mL MTT 的磷酸盐缓冲液（PBS，
        MHz）δ：11.90（1H，s，5-OH），8.09（1H，s，NH），6.39（1H，      pH 7.4）溶液 20 μL，继续培养 4 h 后，每孔加入 DMSO
        s，H-2′，H-6′），5.90（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.86（1H，d，    150 μL，于室温下使用酶标仪于490 nm波长处检测各孔
        J＝2.0 Hz，H-8），5.76（1H，s，3-OH），4.90（1H，d，J＝10.9     的 吸 光 度（A）并 计 算 细 胞 抑 制 率 和 半 数 抑 制 浓 度
        Hz，H-a），4.41（d，J＝11.0 Hz，H-2），4.12（1H，s，H-a），      （IC50 ）。细胞抑制率（％）＝（A 溶剂对照组－A 受试组 ）/（A 溶剂对照组－
        2.18（2H，s，H-c），1.97（1H，s，H-b），1.73（1H，s，H-b）。以     A 空白对照组）×100％。试验重复 3 次，使用 Graph Pad Prism
        上数据证实了蛇葡萄素 7 位羟基与γ-聚谷氨酸 a 位碳上                      7.0 软件对数据进行统计分析，数据均以 x±s 表示，组
        的羧基发生了酯化反应。                                        间比较用 Student’s t 检验；P＜0.05 为差异有统计学意
        2.3.4  元素分析     使用元素分析仪对合成产物进行 C、                  义。结果，蛇葡萄素、γ-PGA-AMP 和 5-FU 对 MCF-7、
        H、N元素含量分析。结果，理论值：C 50.69％、N 7.39％、                 HepG2、A549 细 胞 均 有 明 显 的 抑 制 作 用 ，其 中
        H 5.26％，实测值：C 51.49％、N 7.63％、H 5.20％，两者            γ-PGA-AMP 的抑制作用均强于蛇葡萄素，γ-PGA-AMP
        相近。                                                的 IC50均低于蛇葡萄素。各组细胞抑制率比较见图 5，
        2.3.5  分子量测定      参考文献方法       [13，17] ，采用乌氏黏度     IC50结果见表 1。
        法分别测定0.1％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％（mg/mL）           3 讨论
        的合成产物在1.2 mol/L氯化钠水溶液中的比浓黏度，得                          本研究经紫外光谱法、FT-IR 法、核磁共振法、元素
        到拟合线性曲线的截距值，即合成产物的特性黏度                             分析等方法对合成产物进行表征，结果表明合成产物为
       （[η]）。测量3次，取平均值。结果，合成产物的平均特性                        γ-PGA-AMP。该制备方法可以在较温和的实验条件下
                                                [17]
        黏度为2.178 970。将其代入Mark-Houwink方程 ：[η]＝              合成γ-PGA-AMP，合成产物产率达55.7％。该合成反应
                     1.49
                －9
        9.824×10 ×Mw （其中，Mw为分子量），求得合成产物                    采用高分子物γ-聚谷氨酸对蛇葡萄素的羟基进行酯化修
        中国药房    2020年第31卷第22期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22  ·2723 ·
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