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Sirtinol 组（10 μg/kg Dex+2 μL/100 g Sirtinol），每组 20 色，肝变白、变硬，尾巴变直，四肢抽搐，表明灌注成功）
只。采用盲肠结扎穿孔（CLP）法构建脓毒症大鼠模 后，将大鼠断头取脑，去掉嗅球及小脑，称量大脑半球湿
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型 ：大鼠术前一晚禁食，次日用 2％戊巴比妥钠（0.1 质量，放入 10 mL 组织研磨管中，同时往其中加入 5 mL
mL/100 g）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，腹部消毒后， 二甲基甲酰胺，应用组织匀浆仪将脑组织匀浆，然后转
于其腹正中切开约 1.5 cm 切口，找出盲肠，结扎回盲瓣 移至 15 mL 试管中，并将试管于 60 ℃恒温水浴中孵育
远端盲肠，用无菌注射器针头在结扎处与盲肠末端中点 72 h。孵育结束后，以1 000 r/min离心5 min，弃去沉淀，
处做2次贯通穿孔，挤出肠内容物后，将盲肠连同挤出的 取上清液，采用分光光度计于570 nm波长处测定各样本
肠内容物一同回纳腹腔，缝合切口。Sham 组大鼠进行 及标准品光密度（OD）值，根据标准品浓度（80、40、20、10、
同样实验操作，但不结扎穿孔盲肠。 5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg/mL），利用 Excel
CLP+Dex+Sirtinol 组大鼠于造模前 2 h 经侧脑室注 表计算出标准曲线（y＝ax+b），再根据各样本测得的OD
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射抑制剂Sirtinol，具体操作方法 如下：采用2％戊巴比 值，代入上述标准曲线公式，计算出样本 EB 浓度；再根
妥钠（0.1 mL/100 g）腹腔注射将大鼠麻醉，将其固定在 据公式计算大鼠脑组织中EB含量：EB含量（μg/g）＝EB
脑立体定位仪上，以75％乙醇消毒后暴露颅骨和前囟的 浓度（μg/mL）×二甲基甲酰胺体积（mL）/脑湿质量（g）。
位置，将前囟作为中心点，向右侧旁开1.0 mm，向后面开 大鼠脑组织中 EB 含量越高，表示血脑屏障渗漏程度越
1.6 mm，用小颅钻磨1个骨孔，在骨孔处将微量注射器垂 严重。
直进入深度约3.6 mm处，以0.5 μL/min的速度注射Sirti- 2.2.3 大鼠大脑皮层组织细胞凋亡情况 采用TUNEL/
NeuN 免疫荧光双标染色法进行检测。末次给药 24 h
nol（剂量为2 μL/100 g；以0.5％ DMSO溶液配成浓度为
后，各组分别取4只大鼠，按“2.2.2”项下方法处死后进行
2 mmol/L的溶液，于4 ℃保存，使用前加热至37 ℃使其
心脏灌注，灌注成功后，大鼠断头取脑，冰冻后切片（厚
成透明水样物） 。注射完毕，将注射器停留约5 min，随
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度：8 μm），再采用 0.3％ Triton-X100 打孔破膜，室温封
后注射器每向上拔出1 mm停留5 min，完全拔出后用骨
闭，用 PBS 清洗 5 min×3 次，滴加 NeuN 一抗（稀释度为
蜡将骨孔封闭。处理大鼠手术伤口，麻醉未醒前给予电
1 ∶ 500），4 ℃孵育过夜；将预先混合好的TUNEL反应液
热毯保暖。
中加入绿光荧光二抗，滴加在玻片上（40 μL/片），于
造模结束0、3、6 h后，CLP+Dex组、CLP+Dex+Sirti-
37 ℃下湿盒内避光孵育2 h；用PBS清洗5 min×3次，封
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nol组大鼠分别腹腔注射Dex（剂量为10 μg/kg） ，Sham
片，在荧光显微镜下观察。在大脑皮层区域随机选取 6
组、CLP组大鼠同法注射等体积的生理盐水。
个视野拍照，使用Image Pro Plus 6.0软件对每张图片的
2.2 指标检测
荧光强度和脑细胞数量进行半定量分析。以TUNEL染
2.2.1 大鼠脑组织含水量 采用经典干湿质量法进行
色阳性（镜下显红色荧光，表示凋亡细胞核）和 NeuN 染
检测。末次给药24 h后，各组分别取4只大鼠，采用颈椎
色阳性（镜下显绿色荧光，表示神经元细胞质）反映细胞
脱臼法处死，立即断头取新鲜脑组织，自中线将大脑切
凋亡情况（两者重叠处即为凋亡细胞），计算每个视野的
割成左半球和右半球组织，并分离出小脑组织。称量上
凋亡细胞数量，取平均值（以每mm 凋亡细胞数表示）。
2
述3个部分脑组织的湿质量并记录；然后用锡纸包裹好
2.2.4 大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α水平 采用ELISA法
上述脑组织，迅速置于100 ℃的烘箱中烘烤24 h后再称
进行检测。末次给药 24 h 后，各组分别取 4 只大鼠，按
量，直至恒质量，此时称得的质量即为干质量。按公式
“2.2.2”项下方法处死后进行心脏灌注，灌注成功后，大
计算脑组织含水量：脑组织含水量＝（湿质量－干质量）/
鼠断头取脑，制成匀浆。按照相应试剂盒说明书操作，
湿质量×100％。脑组织含水量越高，则表示大鼠脑水肿 采用酶标仪于450 nm波长处检测IL-1β、TNF-α水平。
越严重。 2.2.5 大 鼠 海 马 组 织 中 SIRT1、p-Akt、p-GSK3 β 、
2.2.2 血脑屏障渗漏程度 采用 EB 示踪剂进行检测。 β-catenin蛋白表达水平 采用Western blotting法进行检
末次给药 24 h 后，各组分别取 4 只大鼠，于尾静脉注射 测。末次给药24 h后，各组分别取4只大鼠，按“2.2.2”项
2％EB 溶液（2 mL/kg）为示踪剂。注射后，可见大鼠如 下方法处死后进行心脏灌注，灌注成功后，大鼠断头取
巩膜、耳廓、前后爪垫等部位迅速变为蓝色，提示注射成 脑。分离海马组织，称定质量，加入现配的含蛋白酶抑
功。2 h后，将大鼠麻醉并处死，使用预冷的PBS进行心 制剂的蛋白裂解液，于冰上研磨，充分裂解 30 min。将
脏灌注[具体方法：用10％水合氯醛（0.3 mL/100 g）深度 组织匀浆转移至 1.5 mL 离心管中，以 12 000 r/min 离心
麻醉大鼠后，开胸、暴露心脏及主动脉，将钝针经心尖处 5 min，取上清液以 BCA 法检测蛋白质浓度。取适量蛋
插入左心室直至主动脉起始部，并在右心耳剪一小口， 白煮沸变性后，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
将 PBS 从输液管滴入大鼠体循环，先快后慢，持续 5～ 泳分离，转膜，再以5％牛血清白蛋白室温封闭1 h，加入
10 min（滴注体积为 200 mL）]，确保将大鼠脑内血液尽 SIRT1、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin 一抗、β-actin 内参（稀
量排出。灌注成功（当大鼠右心耳流出的液体基本无 释度均为1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育过夜；再用TBST溶液清

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