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（序列见表 1）各 0.5 μL。反应条件：50 ℃加热 2 min， 构，利用 Chem3D Ultra 8.0 软件将其能量优化后作为分
95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 1 min， 子对接配体，随后从蛋白质结构数据库（http：//www.rc-
72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参基因， sb.org/pdb/home/home.do）中查找具高分辨率的 S6K 蛋
采用2 －ΔΔCt 法分析目标基因mRNA的相对表达量。上述 白的“PDB”文件作为分子对接受体（PDB 编号：4rlp）。
试验重复3次。 使用AutoDock 4.0软件将S6K蛋白受体与GAC2配体进
表1 PCR引物序列及产物长度 行对接，最后利用Ligplot V.1.4软件进行可视化处理，模
Tab 1 Primer sequence of PCR and product length 拟 S6K 蛋白受体与 GAC2 配体之间的相互作用并计算
基因 引物序列 扩增产物长度，bp 其结合能。结合能数值越小，表明两者相互作用越
HMGCS1 上游：5′-CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC-3′ 160 强 [20-21] 。
下游：5′-TTCAGCAACATCCGAGCTAGA-3′
MVK 上游：5′-GGAGCAAGGTGATGTCACAAC-3′ 138 2.9 统计学方法
下游：5′-CGGCAGATGGACAGGTATAAGT-3′ 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。所有数
DHCR7 上游：5′-GCTGCAAAATCGCAACCCAA-3′ 168 据 均 以 x ± s 表 示 ，组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析
下游：5′-GCTCGCCAGTGAAAACCAGT-3′
SCD 上游：5′-TCTAGCTCCTATACCACCACCA-3′ 82 （One-way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。
下游：5′-TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC-3′ 3 结果
SREBP-2 上游：5′-AACGGTCATTCACCCAGGTC-3′ 133 3.1 GAC2对HL-7702细胞活力的影响
下游：5′-GGCTGAAGAATAGGAGTTGCC-3′
HMGCR 上游：5′-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3′ 102 GAC2 各剂量组细胞的相对活力与空白对照组比
下游：5′-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3′ 较，差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表2。
DHCR24 上游：5′-GCCGCTCTCGCTTATCTTCG-3′ 144 表 2 GAC2 对 HL-7702 细胞相对活力的影响（x±±s，
下游：5′-GTCTTGCTACCCTGCTCCTT-3′
MSMO1 上游：5′-TGCTTTGGTTGTGCAGTCATT-3′ 143 n＝3）
下游：5′-GGATGTGCATATTCAGCTTCCA-3′ Tab 2 Effects of GAC2 on the relative viability of
GAPDH 上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′ 197 HL-7702 cells（x±±s，n＝3）
下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′
组别 细胞相对活力 组别 细胞相对活力
2.7 细胞中S6K/SREBPs通路相关蛋白表达检测 空白对照组 1.00±0.02 GAC2中剂量组 1.08±0.01
采用 Western blotting 法检测。取对数生长期的 GAC2低剂量组 1.08±0.01 GAC2高剂量组 1.00±0.03
HL-7702 细胞，按“2.4”项下方法接种于 6 孔板中，培养 3.2 GAC2对HL-7702细胞中TC、TG含量的影响
24 h后，将其随机分为空白对照组、25-HC组（SREBPs抑 与空白对照组比较，洛伐他汀组和GAC2高剂量组
制剂，1 μmol/L）、雷帕霉素组（S6K抑制剂，1 μmol/L，剂 细胞中 TC 含量以及洛伐他汀组和 GAC2 中、高剂量组
量设置参考已有文献 ）和 GAC2 低、中、高剂量组（5、 细胞中 TG 含量均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），详见
[19]
10、20 μmol/L），每组设 5 个复孔。空白对照组加入含 表3。
1‰DMSO 的完全培养基 2 mL，各给药组加入含相应药 表 3 GAC2 对 HL-7702 细胞中 TG、TC 含量的影响
物的完全培养基2 mL。培养18 h后，弃去培养基，加入 （x±±s，n＝3）
RIPA 裂解液裂解以提取总蛋白；蛋白于 95 ℃变性 10 Tab 3 Effects of GAC2 on the contents of TG and TC
min后，采用BCA法测定蛋白含量。取变性蛋白适量进 in HL-7702 cells（x±±s，n＝3）
行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并湿法转移 组别 TC TG
至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以脱脂牛奶室温封闭 1 空白对照组 1.01±0.04 1.00±0.03
h，加入 SREBP-1、SREBP-2、S6K、p-S6K 一抗（稀释度均 洛伐他汀组 0.73±0.03 ＊＊ 0.73±0.04 ＊＊
GAC2低剂量组 0.96±0.02 0.85±0.80
为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以TBST溶液清洗10 min×4
GAC2中剂量组 0.91±0.02 0.75±0.01 ＊＊
次，随后加入相应二抗（SREBP-1 对应 HRP 标记的山羊 GAC2高剂量组 0.86±0.01 ＊ 0.68±0.01 ＊＊
抗小鼠 IgG 二抗，SREBP-2、S6K、p-S6K 对应 HRP 标记 注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
的山羊抗兔 IgG 二抗，稀释度均为 1 ∶ 2 000）室温孵育 Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
1.5 h，以 TBST 溶液清洗 10 min×4～5 次。经 ECL 试剂 3.3 GAC2对HL-7702细胞中脂质堆积的影响
显色后，于凝胶成像仪上成像，使用Image J V1.8.0软件 空白对照组细胞中可见大量桔红色脂滴；各给药组
分析，以成熟 SREBPs（n-SREBPs）与内参（β-actin）条带 细胞中的脂滴有所减少，且随着 GAC2 剂量的增加，脂
的灰度值比值表示 SREBPs 的相对表达量，并记录 滴有逐渐减少的趋势，详见图2。
p-S6K与S6K的相对表达量比值（简称为“p-S6K/S6K比 3.4 GAC2 对 HL-7702 细胞中 SREBPs 荧光素酶相对
值”）。上述试验重复3次。 活性的影响
2.8 S6K与GAC2的分子对接 与空白对照组比较，25-HC 组和 GAC2 低、中、高剂
采用 Chem Draw Ultra 8.0 软件绘制 GAC2 分子结 量组细胞中的 SREBPs 荧光素酶相对活性均显著降低

·2354 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19 中国药房 2020年第31卷第19期