Page 55 - 2020年19期
P. 55

Cell Signaling公司，批号分别为2708、9205S）；辣根过氧             盒说明书方法操作，使用全波长酶标仪于500 nm波长处
        化物酶（HRP）标记的小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克                   检测 OD 值，并以试验组与空白对照组 OD 值的比值表
        隆抗体、HRP 标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白 G（IgG）二                      示TC、TG的含量。上述试验重复3次。
        抗、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗（武汉三鹰生物技术                      2.4 细胞内脂质堆积情况观察
        有限公司，批号分别为 66009、SA00001-1、SA00001-2）；                 采 用 尼 罗 红 染 色 法    [14] 观 察 。 取 对 数 生 长 期 的
        Hiscript Ⅱ qRT  Super MixⅡ逆转录试剂盒（南京诺唯              HL-7702 细胞，用完全培养基调整细胞密度后，以 2.4×
        赞 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 ：R323-01）；Power Up     TM   10 个/孔接种于6孔板中，培养12 h后，按“2.3”项下方法
                                                             5
        SYBR TM  Green PCR Master Mix 试 剂 盒（美 国 Thermo     分组，每组设置3个复孔。空白对照组加入含1‰DMSO
        Fisher Scientific 公司，批号：775498）；DMEM 高糖培养          的完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培
        基（美国 Corning 公司，批号：10013023）；荧光素酶报告                养基 2 mL。培养 18 h 后，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 为
        基因试剂盒（含报告基因裂解液和报告基因裂解底物，                           7.2～7.4）清洗 3 min×3 次，随后每孔加入 100 μg/mL 尼
        美国 Promega 公司，批号：0000312919）；ECL 显色试剂              罗红染液500 μL，于37 ℃下避光染色10 min后，弃去染
        盒（美国 Bio-Rad 公司，批号：1705061）；二甲基亚砜                  液；用 PBS 清洗后，使用荧光显微镜观察并拍照（染色
       （DMSO）等其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。                             后，细胞中若有脂质堆积则可见桔红色脂滴 ）。
                                                                                                [15]
        1.3 细胞与质粒                                          2.5 细胞中SREBPs荧光素酶活性检测
                                                                                      [16]
            人肝细胞 HL-7702 购自美国模式培养物研究所                          采用荧光素酶报告基因法 检测。取对数生长期
       （ATCC）细胞库；SREBPs报告基因质粒由河南中医药大                       的HL-7702细胞，按“2.2”项下方法接种于96孔板中，待
        学中医药科学院谢治深博士惠赠。                                    细胞铺板融合度超过 70％时，将其随机分为空白对照
        2 方法                                               组、25-HC组（阳性对照，1 μmol/L，剂量设置参考已有文
                                                             [17]
        2.1  细胞培养                                          献 ，下同）和GAC2低、中、高剂量组（5、10、20 μmol/L），
            将 HL-7702 细胞置于含 10％胎牛血清、1％青-链霉                 每组设6个复孔。所有组细胞均瞬时转染SREBPs报告
        素双抗的DMEM高糖培养基（以下简称“完全培养基”）                         基因质粒，并于转染 6 h 后更换完全培养基，继续培养。
        中，于37 ℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养（培养条                      次日，弃去各孔上清液，空白对照组加入含1‰DMSO的
        件下同），隔天换液 1 次；待细胞生长融合至约 80％时，                      新鲜培养基（以等体积混合的F-12K Nutrient Mixture培
        进行传代培养。                                            养基和 DMEM 高糖培养基为基质，并含有 5％LPDS、
        2.2  细胞相对活力检测                                      1％青-链霉素双抗、10 μmol/L 美伐他汀，下同）100 μL，
            采用MTT法检测。取对数生长期的HL-7702细胞，                     各给药组加入含相应药物的新鲜培养基 100 μL。培养
        用完全培养基调整细胞密度后，以 1.2×10 个/孔接种于                      18 h 后，弃去培养基，加入报告基因裂解液振摇裂解 30
                                            4
        96 孔板中，培养 24 h 后，将其随机分为空白对照组和                      min，随后加入报告基因裂解底物，使用多功能酶标仪于
        GAC2低、中、高剂量组（5、10、20 μmol/L，剂量设置参考                 560 nm 波长处检测各孔的化学发光值，同时按照 BCA
        本课题组前期预试验结果，下同），每组设置 5 个复孔。                        蛋白浓度试剂盒说明书方法检测各孔的蛋白含量，并计
        空白对照组加入含 1‰DMSO 的完全培养基 100 μL，各                    算 SREBPs 的荧光素酶相对活性：荧光素酶相对活性＝
        给药组加入含相应药物的完全培养基 100 μL。培养 18                      （试验组化学发光值/试验组蛋白含量）/（空白对照组化
        h 后，加入 5 mg/mL MTT 试剂 20 μL，继续培养 4 h，弃去            学发光值/空白对照组蛋白含量）。上述试验重复3次。
        培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振摇10 min，使用全波                  2.6  细胞中SREBPs及其下游基因mRNA表达检测
        长酶标仪于 490 nm 波长处测定各孔的光密度（OD）值，                         采用实时荧光定量 PCR 法 检测。取对数生长期
                                                                                       [18]
        并计算细胞的相对活力：相对活力＝（试验组OD值－对                          的 HL-7702 细胞，按“2.4”项下方法接种于 6 孔板中，培
        照组OD值）/对照组OD值。上述试验重复3次。                            养12 h后，将其随机分为空白对照组、25-HC组（阳性对
        2.3 细胞中TC、TG含量检测                                   照，1 μmol/L）和 GAC2 中、高剂量组（10、20 μmol/L，为
            采用生化法检测。取对数生长期的HL-7702细胞，                      验证“2.5”项下结果暂只设定了中、高剂量），每组设3个
        按“2.2”项下方法接种于96孔板中，培养24 h后，将其随                     复孔。空白对照组加入含 1‰DMSO 的完全培养基 2
        机分为空白对照组、洛伐他汀组（阳性对照，1 μmol/L，剂                     mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基 2 mL。培
        量设置参考已有文献 ）和 GAC2 低、中、高剂量组（5、                      养18 h后，采用Trizol法提取细胞RNA，按照Hiscript Ⅱ
                           [13]
        10、20 μmol/L），每组设置6个复孔。空白对照组加入含                    qRT Super MixⅡ逆转录试剂盒说明书转录得cDNA，使
        1‰DMSO 的完全培养基 100 μL，各给药组加入含相应                     用 Power Up TM  SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒以
                                                                             TM
        药物的完全培养基 100 μL。培养 18 h 后，用胰酶消化，                   实时荧光定量 PCR 仪进行扩增。反应体系（共 10 μL）：
        以1 000 r/min离心5 min，收集沉淀，严格按照相应试剂                  cDNA 4 μL，SYBR Green Mix 试剂 5 μL，上、下游引物


        中国药房    2020年第31卷第19期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19  ·2353 ·
   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60