Page 19 - 2020年19期
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1.3 细胞                                             释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用三羟甲基氨基甲烷
            ER（+）人乳腺癌T-47D细胞株由上海复祥生物科技                     盐酸盐（TBST）溶液清洗10 min×3次，加入二抗（稀释度
        有限公司提供。                                            为1 ∶ 10 000），室温孵育1 h；用TBST溶液清洗10 min×3
        2 方法                                               次，经 ECL 显色后，于超高灵敏化学发光成像系统上成
        2.1 细胞培养及预处理                                       像。使用 Image-Pro Express 5.1 软件分析，以相应蛋白
            将 T-47D 细胞置于含 10％FBS、1％青-链霉素双抗                 与内参β-actin 条带的灰度值比值作为目标蛋白的表达
        的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、5％CO2、相对饱和湿                      量。上述试验重复3次。
        度的条件下培养（培养条件下同）。于试验开始前 3 d，                        2.4 细胞中ER-α、ER-β mRNA表达情况检测
        用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗 2 次后，替换为含                        采用 RT-PCR 法检测。取“2.1”项下经培养且处于
        5％CDT-FBS、1％青-链霉素双抗的无酚红 DMEM 高糖                    对数生长期的细胞，按“2.3”项下方法培养、分组、给药，
        培养液继续培养，以进一步增加细胞对雌激素样物质的                           每组设 3 个复孔。培养 48 h 后，收集细胞，参照 TRNzol
              [8]
        敏感性 。                                              Universal 总 RNA 提取试剂说明书方法提取总 RNA，使
        2.2 细胞增殖情况检测                                       用超微量分光光度计测定其纯度（即A260 nm/A280 nm值，若该
                                                                                                  [10]
            采用CCK-8法检测。取“2.1”项下经培养且处于对                     值为 1.8～2.0 即表明其纯度符合试验要求 ）。参照
        数生长期的细胞适量，用PBS清洗2次，经0.25％胰蛋白                       FastKing 一 步 法 RT-PCR 试 剂 盒 说 明 书 方 法 进 行
        酶消化后，以不含血清的 DMEM 高糖培养液调整细胞                         RT-PCR。反应体系（50 μL）：总 RNA 2 μL，2×FastKing
                      3
        密度，并按 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，每孔总体积为                    One Step RT-PCR Master Mix 25 μ L，25 × RT-PCR En-
        150 μL。培养 24 h 待细胞贴壁后，将其随机分为空白                     zyme Mix 2 μL，上/下游引物各 1.25 μL、无 RNA 酶的
        组、β-E2组[1×10 －8  mol/L，以含DMSO、5％CDT-FBS、1％         ddH2O 18.5 μL。反应条件：40 ℃逆转录30 min；95 ℃预
        青 链 霉 素 、双 抗 的 无 酚 红 DMEM 高 糖 培 养 基 稀 释            变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30
       （DMSO 最终体积分数为 0.000 3％），浓度参考文献方                     s，共循环35次；72 ℃再延伸5 min。扩增产物行1.2％琼
          [9]
        法 和本课题组前期预试验结果设置；下同]和TSG不同                         脂糖凝胶电泳后，于超高灵敏化学发光成像系统上成
                          －5
                                －6
        浓度组（1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10      －8  mol/L，浓  像。使用 Image Lab 5.2.1 软件分析，以相应基因与内参
                   －4
                                       －7
        度参考本课题组前期预试验结果设置），每组设 6 个复                         β-actin 条带的灰度值比值作为目标基因 mRNA 的表达
        孔。吸弃上清液，空白组加入含5％CDT-FBS、1％青-链                      量。上述试验重复3次。
        霉素双抗的无酚红 DMEM 高糖培养液 150 μL，各给药                     2.5  统计学方法
        组加入含相应药物以及 5％CDT-FBS、1％青-链霉素双                          采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资
        抗的无酚红 DMEM 高糖培养液 150 μL。分别于培养                      料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜
        24、48、72 h时，各孔加入CCK-8试剂15 μL，于37 ℃孵育               0.05为差异有统计学意义。
        2 h，使用荧光/吸收光酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔                    3 结果
        的吸光度（A），计算细胞增殖率：增殖率（％）＝（试验组                        3.1  TSG对T-47D细胞增殖的影响
        平均A值/空白组平均A值）×100％。上述试验重复3次。                           与空白组比较，β-E2 组和 TSG 各浓度组各时间点
        2.3  细胞中ER-α、ER-β蛋白表达情况检测                          （除β-E2组48 h外）的细胞增殖率均显著升高（P＜0.05或
                                                                                           － 7
            采用 Western blotting 法检测。取“2.1”项下经培养            P＜0.01），且用药 72 h 时 TSG 1×10 、1×10 、1×10       － 5
                                                                                                  － 6
        且处于对数生长期的细胞适量，用 PBS 清洗 2 次，经                       mol/L 组的细胞增殖率均显著高于β-E2组（P＜0.05），详
        0.25％胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培养                        见表2。根据上述结果，本研究以1×10 、1×10 、1×10                －4
                                                                                            －8
                                                                                                   －6
        液调整细胞密度，并按1×10 个/孔接种于6孔板中，每孔                       mol/L作为TSG的低、中、高浓度进行后续试验。
                               6
        总体积为2 mL。培养24 h待细胞贴壁后，将其随机分为                       3.2 TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白表达的影响
        空白组、β-E2组（1×10    －8  mol/L）和 TSG 低、中、高浓度组             与空白组比较，各给药组细胞中ER-α、ER-β蛋白的
       （浓度参考“2.2”项下试验结果设置），每组设 4 个复孔。                      表达量均显著升高，且 TSG 低浓度组 ER-β蛋白的表达
        吸弃上清液，空白组加入含5％CDT-FBS、1％青-链霉素                      量显著高于β-E2组（P＜0.05 或 P＜0.01）。其中，β-E2组
        双抗的无酚红 DMEM 高糖培养液 2 mL，各给药组加入                      细胞中 ER-α、ER-β蛋白的表达量分别增加了 56％、
        含相应药物以及 5％CDT-FBS、1％青-链霉素双抗的无                      29％，TSG低、中、高浓度组细胞中上述蛋白的表达量分
        酚红DMEM高糖培养液2 mL。培养48 h后，收集细胞，                      别增加了 61％、69％、30％（ER-α）和 83％、28％、34％
        经细胞裂解液裂解后，以12 000 r/min离心15 min，取上                 （ER-β），详见图1、表3。
        清液按 BCA 法测定蛋白浓度。将蛋白于 100 ℃变性 5                     3.3 TSG 对 T-47D 细胞中 ER-α、ER-β mRNA 表达的
        min 后，取 20 μg 行 SDS-PAGE。电泳后转移至 PVDF 膜             影响
        上，室温封闭 15 min，加入 ER-α、ER-β和β-actin 一抗（稀                与空白组比较，各给药组细胞中ER-α、ER-β mRNA


        中国药房    2020年第31卷第19期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19  ·2317 ·
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