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量设置参考成人等效剂量并按人鼠体型系数换算而                             值的比值表示该目标蛋白的表达量。
        得]，D～F 组大鼠均灌胃相应姜黄素混悬液[55、110、                      2.4 统计学方法
        165 μg/（kg·d），以水为溶剂；剂量设置参考本课题组前                        采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
        期预实验结果]。灌胃体积均为 30 mL/kg，每日 1 次，连                   料以 x±s 表示，多组间比较采用 F 检验，组间两两比较
        续12周。                                              采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
        2.3 标本采集与指标检测                                      3 结果
        2.3.1  血清骨代谢标志物 BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、                 3.1 各组大鼠血清骨代谢标志物含量比较
        PINP、OC 含量检测       末次给药后，处死大鼠，于心脏取                     与A组比较，B组大鼠血清BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、
        血 2 mL，以 3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，采用             PINP、OC含量均显著降低（P＜0.05）。与B组比较，C～
        ELISA 法以酶标仪检测各组大鼠血清中 BALP、CBF-                     F组大鼠血清上述指标均显著升高（P＜0.05）；且E组、F
        α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC 的含量，严格按照相应试剂盒说                    组显著高于 D 组，F 组显著高于 E 组（P＜0.05），详见
        明书操作。                                              表2。
        2.3.2 BMD及骨小梁微结构参数检测               分离各组大鼠          表 2   各组大鼠血清骨代谢标志物含量比较（x±±s，n＝
        右侧股骨标本，使用实验动物微型 CT 影像系统对远端                               15）
        干骺端进行扫描（扫描电压：65 kV，电流：384 mA，分辨                    Tab 2 Comparison of serum bone metabolism mar-
        率：18 μm）。扫描完成后，选择感兴趣区域（ROI）行三维                             kers of rats in each group（x±±s，n＝15）
        重组后提取图像资料，利用专用骨骼分析软件 Ad-                           组别   BALP，μg/L  CBF-α1，μg/L  CTX-Ⅰ，μg/L  PINP，μg/L  OC，μg/L
        vanced Bone Analysis（ABA）2.0 进行骨组织计量学分             A组  22.12±10.21  48.73±12.74  13.11±5.32  31.23±10.16  18.44±11.23
                                                           B组  16.34±11.17 ＊  21.85±18.15 ＊  8.41±3.33 ＊  24.36±9.55 ＊  11.78±10.23 ＊
        析，包括 BMD、相对骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量
                                                           C组  21.42±10.26 #  36.67±15.41 #  11.47±2.17 #  27.42±11.17 #  14.56±11.88 #
       （Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、连接密度（Conn.D）、骨小                 D组  18.32±11.17 #  31.39±13.65 #  10.64±5.56 #  27.05±10.74 #  14.77±10.06 #
        梁分离度（Tb.Sp）、结构模型指数（SMI）。上述所有操作                     E组  19.56±10.44 #Δ  37.74±17.62 #Δ  11.49±7.33 #Δ  28.84±15.24 #Δ  16.01±10.04 #Δ
                                                           F组  20.32±11.18 #Δ□  41.18±15.35 #Δ□  12.17±11.12 #Δ□  29.14±10.33 #Δ□  17.99±10.26 #Δ□
        均由同一组研究人员完成。
                                                                                           #
                                                               注：与 A 组比较，P＜0.05；与 B 组比较，P＜0.05；与 D 组比较，
                                                                           ＊
        2.3.3  下丘脑和股骨组织中 OPG、RANKL mRNA 表达
                                                                           □
                                                           Δ
                                                            P＜0.05；与E组比较，P＜0.05
        情况检测      采用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检                       Note：vs. group A，P＜0.05；vs. group B，P＜0.05；vs. group D，
                                                                                           #
                                                                           ＊
        测。各组大鼠采血后，取其下丘脑和股骨组织适量，用                           Δ P＜0.05；vs. group E，P＜0.05
                                                                           □
        RNA 抽提试剂盒提取组织中总 RNA，对 RNA 纯度、含                     3.2  各组大鼠BMD及骨小梁微结构参数比较
        量进行检测后使用逆转录试剂盒获取 cDNA。以上述                              与 A 组比较，B 组大鼠 BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、
        cDNA 为模板，进行扩增。反应体系（共 20 μL）：SYBR                   Conn.D 均 显 著 降 低 ，Tb.Sp、SMI 均 显 著 升 高（P＜
        Pri mix 10 μL，上、下游引物各 1 μL，模板 cDNA 2 μL，           0.05）。与 B 组比较，C～F 组大鼠 BMD、BV/TV、Tb.N、
        ddH2O 6 μL；反应条件：95 ℃预变性 20 s；95 ℃变性 10             Tb.Th、Conn.D均显著升高，且E组、F组上述指标均显著
        s，62 ℃退火 30 s，70 ℃延伸 30 s，共 45 个循环。以               高于 D 组，F 组显著高于 E 组；Tb.Sp、SMI 均显著降低，
        GAPDH 为内参，使用荧光定量 PCR 仪检测，并以 2               －ΔΔCt  且 E 组、F 组上述指标均显著低于 D 组，F 组显著低于 E
        法计算各目标mRNA的表达量（Ct表示每个反应管内荧                         组（P＜0.05），详见表3。
        光信号强度达到设定阈值时所经历的循环数）。                              3.3  各组大鼠下丘脑和股骨组织中 OPG、RANKL
        2.3.4  下丘脑和股骨组织中OPG、RANK蛋白表达情况                     mRNA表达量比较
        检测    采用 Western blotting 法检测。取“2.3.3”项下各              与 A 组比较，B 组大鼠下丘脑和股骨组织中 OPG
        组大鼠下丘脑和股骨组织适量，加入 RIPA 裂解液于冰                        mRNA 的表达量显著降低，RANKL mRNA 的表达量显
        上裂解 30 min，采用 BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白浓                     著升高（P＜0.05）。与 B 组比较，C～F 组大鼠下丘脑及
        度。蛋白经变性后，取适量用上样缓冲液稀释，行十二                           股骨组织中OPG mRNA的表达量均显著上升，且E组、F
        烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至聚偏二氟                           组上述指标显著高于 D 组，F 组显著高于 E 组；RANKL
        乙烯膜上，于4 ℃下加入相应一抗（稀释度均为1 ∶ 500），                    mRNA的表达量均显著降低，且E组、F组上述指标均显
        4 ℃孵育过夜；以三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液                       著低于D组，F组显著低于E组（P＜0.05），详见表4。
        洗涤5 min×3次，加入相应二抗（稀释度均为1 ∶ 500），室                  3.4  各组大鼠下丘脑和股骨组织中OPG、RANKL蛋白
        温孵育 2 h；以 TBST 溶液洗涤 5 min×3 次，以 ECL 试剂             表达量比较
        显色后，于成像系统上成像并使用QuantityOne v4.52软                      与A组比较，B组大鼠下丘脑和股骨组织中OPG蛋
        件进行分析。以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度                      白的表达量显著降低，RANKL 蛋白的表达量显著上升


        中国药房    2020年第31卷第17期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 17  ·2121 ·
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