Page 41 - 2020年17期
P. 41

批号：150809，纯度：＞98％）；褪黑素对照品（北京索莱                     正反射消失的时间，作为入睡潜伏期；观察并记录大鼠
        宝生物科技有限公司，批号：917D021，纯度：≥99.0％）；                   翻正反射消失至觉醒的时间，作为睡眠持续时间。
        PCPA、戊巴比妥钠（美国Sigma公司，批号：10026000696、               2.3.3  大鼠血清中褪黑素水平测定               末次给药后 2 h
        57-30-0，纯度：100％、＞99.0％）；聚山梨酯80（湖北省医                时，以 10％水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，然后于腹主
        药公司化玻站，批号：080308，化学纯）；褪黑素酶联免疫                      动脉取血2 mL。将血样以3 000 r/min离心10 min，收集
        吸 附（ELISA）检 测 试 剂 盒（德 国 IBL 公 司 ，批 号 ：             血清。采用 ELISA 双抗体夹心法检测血清中褪黑素水
        EME174）；RNA提取试剂盒、实时荧光定量-PCR检测试                     平，具体操作按试剂盒说明书进行。
        剂盒（德国 Qiagen 公司，批号：160052260、163018617）；           2.3.4  大鼠松果体病理组织学观察              取血后，每组随机
        cDNA合成试剂盒（瑞士Roche公司，批号：04379012001）；               选3只大鼠处死并沿枕骨大孔开颅，将大脑人字缝上部
        其余试剂均为分析纯，水为超纯水。PCR引物均由生工                          充分暴露，可见椭圆形米粒大小的松果体。完整剖取松
        生物工程（上海）股份有限公司合成。                                  果体，置于10％甲醛溶液中固定48 h，常规脱水、石蜡包
        1.3 动物                                             埋、切片（厚度5 µm），然后行苏木精-伊红（HE）染色，在
            SPF 级健康 SD 大鼠 60 只，雄性，体质量 160～180              显微镜下观察松果体病理组织学变化。
        g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号：                        2.3.5  大鼠松果体超微结构观察             取血后，每组随机选
        SCXK（京）2016-0002。大鼠购入后饲养于山西省中医                     2只大鼠，按“2.3.4”项下方法快速剖取松果体，于30 s内
        药研究院中心实验室，环境温度为22～24 ℃、相对湿度                        置于2％戊二醛溶液中固定2 h，然后转至0.1 mol/L磷酸
        为40％～50％。本实验严格遵循科技部颁发的《关于善                         盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中，常规 1％锇酸固定、脱水、包
        待实验动物的指导性意见》中对动物处理的有关规定进                           埋、切片（厚度 70 nm）、电子染色后，置于电子显微镜下
        行操作。                                               观察松果体超微结构变化。
        2 方法                                               2.3.6  大鼠松果体生物钟基因检测              取血后，取各组剩
        2.1  分组与造模                                         余的5只大鼠，按“2.3.4”项下方法快速剖取松果体，采用
            大鼠适应性喂养 1 周后，根据随机数字表法分为空                       Trizol 法分离提取其总 RNA，检验纯度和浓度后，将总
        白对照组、模型对照组、阳性对照组和异虎耳草素高、                           RNA 逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩
        中、低剂量组，每组 10 只。除空白对照组外，其余各组                        增。反应体系：cDNA模板3 μL，上、下游引物各2.5 μL，
                          [7]
        大鼠均参考文献方法 并进行优化后复制松果体损伤模                           2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、无
        型：腹腔注射PCPA混悬液450 mg/kg[按文献方法 加入                    酶水 4.5 μL，总体系为 25 μL。反应条件：95 ℃预变性
                                                  [9]
        溶剂 0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 10.1），80 ℃水浴加热              30 s；95 ℃变性5 min，95 ℃退火10 s，60 ℃延伸35 s，共
        30 min，超声（功率：250 W，频率：25 kHz）处理 5 min，制            40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，
        成4.5％PCPA混悬液]，每天1次，连续2 d。空白对照组                     采用 2  －ΔΔCt 法计算 Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1
        大鼠腹腔注射等量、等pH的0.1 mol/L碳酸盐缓冲液。                      和 Cry2 基因的 mRNA 表达水平（其中 Ct 表示每个反应
        2.2  给药                                            管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数）。
            分别将褪黑素、异虎耳草素溶于2％聚山梨酯80溶                        引物序列及扩增产物长度见表1。
        液（量取2 mL聚山梨酯80加水至100 mL制得）中，制成                                表1 引物序列及扩增产物长度
        褪黑素质量浓度为 1 mg/mL 和异虎耳草素质量浓度分                       Tab 1  Primary sequence and length of amplification
        别为 0.3、0.15、0.075 mg/mL 的溶液。在“2.1”项下造模                    product
                                           [10]
        后，阳性对照组大鼠灌胃褪黑素10 mg/kg ，异虎耳草素                      基因名称      上游（5′→3′）         下游（5′→3′）     产物长度，bp
        高、中、低剂量组大鼠分别灌胃异虎耳草素 3、1.5、0.75                     Clock  GCCGCAGAATAGCACCCAGAGT  ACTTGGCACCATGACGGCCC  136
                                                           Bmal1  CCGATGACGAACTGAAACACC  TCTTCCCTCGGTCACATCCT  78
        mg/kg ，空白对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积 2％                       Per1  AGCGCATCCACTCTGGTT  GTCGGTCCTCAGGATGTA  183
             [7]
        聚山梨酯80溶液，每天给药1次，连续给药7 d。                           Per2  GACACCCTACCTGGTCAA  CATCCTGGAACAGGCAGT  164
        2.3 指标检测                                           Per3  CCGGGATGTGTGTTTCTTGAAG  TGGTGTACTGCAACCATCAGAG  134
                                                           Cry1  AATGGAGCCCCTGGAGAT  TGGTGTACTGCAACCATCAGAG  235
        2.3.1  一般情况观察       腹腔注射 PCPA 混悬液完毕后，              Cry2  GGCAGAAACCACCCCTTA  CTAAGGAAGGCACGCCAT  159
        观察各组大鼠的精神状态及活动情况。                                  GAPDH  ATGGGAAGCTGGTCATCAAC  CCACAGTCTTCTGAGTGGCA  375
        2.3.2  大鼠戊巴比妥钠协同睡眠实验              给药第6 天，各         2.4 统计学方法
        组大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠 38 mg/kg。睡眠以翻正                           采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以
        反射消失为指标；以大鼠背向下姿势保持30 s以上者判                         x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
        断为翻正反射消失。记录注射戊巴比妥钠后至大鼠翻                            比较采用 LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学


        中国药房    2020年第31卷第17期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 17  ·2083 ·
   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46