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CO2细胞培养箱中培养（以下培养条件相同）。待细胞生                         12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA法进行蛋
        长达 80％～90％融合时，加入胰蛋白酶消化传代，取第                        白浓度测定。将蛋白样品煮沸10 min使其变性后，取适
        3～5代细胞用于试验。另取PIO、GW9662适量，分别用                      量小心上样，待电泳后转移至PVDF膜上，将膜放入5％
        DMSO 溶解制成 PIO、GW9662 母液，试验时以含血清                    脱脂奶粉液中，于室温下温和振荡封闭 1 h；以 TBST 缓
        DMEM培养基稀释（确保DMSO体积分数不超过0.1％）。                      冲液在摇床上洗涤3次后，分别加入β-actin、E-cadherin、
        2.2 MTT法检测PIO对NRK-52E细胞活性的影响
                                                           α-SMA、p-AKT  （Thr308） 抗体（稀释度均为 1 ∶ 400），PPARγ、
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            将NRK-52E细胞制成密度为2.5×10 个/L的细胞悬
                                                           PTEN抗体（稀释度均为1 ∶ 800）和AKT1抗体（稀释度为
        液，以200 μL/孔接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培
                                                           1 ∶ 300），于 4 ℃下在摇床上温和振荡孵育过夜；加入相
        养，待细胞生长达80％融合时，换无血清DMEM培养基
                                                           应的羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（分别对应 PPARγ、
        将细胞静置24 h后，再换为100 μL含2％FBS的DMEM
                                                           p-AKT （Thr308） 、PTEN、AKT1、E-cadherin 一 抗 和 β-actin、
        培养基配制的不同浓度PIO培养液。根据培养液中PIO
                                                           α-SMA 一抗，稀释度均为 1 ∶ 5 000），于室温下在摇床上
        浓度的不同分为 7 组，即空白对照组（不含细胞或 PIO，
                                                           温和振荡孵育 1 h；以 TBST 缓冲液在摇床上洗膜 3 次，
        检测时调零用）、阴性对照组（含细胞但不含PIO）和不同
        浓度 PIO 组（0.1、1.0、2.5、5.0、10 μmol/L，浓度按预试验          加入ECL显色剂，并在凝胶成像系统中曝光显影。采用
        结果设置），每组设5个复孔。细胞继续培养48 h后，每                        Image Lab 5.1 图像分析软件对目的蛋白条带进行灰度
        孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h，完全             分析，计算其与内参（β-actin或AKT1）灰度值的比值，以
        吸弃上清后加Formazan溶解液150 μL，置于摇床上低速                    表示目的蛋白的相对表达水平。
        振荡10 min，充分溶解紫色结晶物甲臢（Formazan）。采                   2.6 统计学方法
        用全自动酶联免疫检测仪在波长570 nm处测定各孔的                             采用SPSS 20.0软件对试验数据进行统计分析。计
        吸光度（OD），OD值越大则表明细胞活性越高。                            量资料以x±s表示，采用t检验进行组间比较。P＜0.05
        2.3  细胞分组与处理                                       为差异有统计学意义。
            根据预试验和“2.2”项下 MTT 法试验结果，将细胞                    3 结果
        随机分组——（1）对照组：5.5 mmol/L 葡萄糖（以含 2％                  3.1  不同浓度PIO对NRK-52E细胞活性的影响
        FBS的DMEM培养基配制，下同）；（2）高糖组：30 mmol/L
                                                               MTT试验结果显示，PIO 0.1～2.5 μmol/L浓度组细
        葡萄糖；（3）PIO 干预组：30 mmol/L 葡萄糖+5.0 μmol/L
                                                           胞活性与阴性对照组比较均呈升高趋势，且当PIO浓度
        PIO；（4）GW9662干预组：30 mmol/L葡萄糖+5.0 μmol/L
                                                           为 2.5 μmol/L 时，对细胞增殖有显著促进作用（P＜
        PIO+5.0 μmol/L GW9662。各组细胞加入相应的葡萄糖
                                                           0.05）；PIO 5～10 μmol/L浓度组细胞活性与阴性对照组
        或/和药物后进行培养，其中对照组、高糖组和 PIO 干预
        组均分别设 6、12、24、48 h 共 4 个时间点进行相关指标                  比较均呈下降趋势，且当PIO浓度为10 μmol/L时，其对
        动态检测，GW9662 干预组在 48 h 时进行相关指标检                     细胞增殖有显著抑制作用（P＜0.05）。这表明 PIO 对
        测。分别提取各组细胞的 RNA 和蛋白用于后续检测。                         NRK-52E 细胞活性的影响具有双相性。本次研究选择
        试验均重复6次。                                           5 μ mol/L 的 PIO 进 行 后 续 试 验 。 不 同 浓 度 PIO 对
        2.4  Real-time PCR 法检测 NRK-52E 细胞中 PPARγ、          NRK-52E细胞活性的影响见图1。
        PTEN mRNA的表达水平                                           1.0                   ＊
            采用 TRIzol 法提取各组细胞总 RNA，再采用核酸
                                                                 0.9
        蛋白分析仪检测 RNA 浓度和纯度后，以所提取的 RNA
                                                                 0.8
        为模板逆转录合成 cDNA。采用荧光定量 PCR 分析系
        统进行检测，以“1.3”项下相应引物进行 PCR 反应。反                           OD570 nm值  0.7                     ＊
        应体系（25 μL）：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNas-           0.6
        eH Plus）12.5 μL，灭菌水8.5 μL，上、下游引物各1 μL，cD-                0.5
        NA 2 μL。反应条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，                    0.4
        60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，重复 40 个循环。以                       0 μmol/L  0.1 μmol/L 1 μmol/L 2.5 μmol/L  5 μmol/L 10 μmol/L
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        β-actin 为内参，采用 2   －ΔΔCt 法计算各组细胞中 PPARγ、               注：与阴性对照组比较，P＜0.05
                                                                               ＊
        PTEN mRNA的相对表达水平。                                      Note：vs. negative control group，P＜0.05
                                                                                    ＊
        2.5  Western blotting法检测NRK-52E细胞中PPARγ、           图 1   不同浓度 PIO 对 NRK-52E 细胞活性的影响（x±±
        PTEN、E-cadherin、α-SMA、p-AKT    （Thr308） 蛋 白 的 表 达        s，n＝5）
        水平                                                 Fig 1 Effects of PIO with different concentrations on
            各组细胞以 RIPA 强裂解液裂解后，于 4 ℃下以                            viability of NRK-52E cells（x±±s，n＝5）


        中国药房    2020年第31卷第16期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16  ·1951 ·
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