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protein expression of PPARγ and PTEN，protein expression of E-cadherin，α-SMA and p-AKT （Thr308）  between GW9662 intervention
        group and high-glucose group；the effect of PIO was blocked by PPAR γ antagonist GW9662. CONCLUSIONS：PIO may
        up-regulate the expression of PTEN by activating PPARγ，inhibit PI3K/AKT signaling pathway so as to inhibit the occurrence of
        EMT of renal tubular epithelial cells.
        KEYWORDS     Pioglitazone；Renal tubular epithelial cell；PPARγ；PTEN；PI3K/AKT signaling pathway；Epithelial-mesenchymal
        transition；Rat


            糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）的发病机制            （FBS，浙 江 天 杭 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ，批 号 ：
        十分复杂。有研究表明，肾小管上皮细胞-间充质细胞                            20170316）；DMEM 培养基、胰蛋白酶、cDNA Synthesis
        转分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在促进       Kit逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批
        肾间质纤维化及 DN 的发生发展中均有重要作用，是导                          号：8117033、1785989、00285627）；兔抗大鼠 PPARγ单克
        致 DN 肾损伤的主要机制         [1-2] 。第 10 号染色体缺失的磷          隆抗体、兔抗大鼠 PTEN 单克隆抗体、小鼠抗大鼠α-平
        酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）可通过负性调控磷脂                          滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体（美国 CST 公司，批
        酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路而发                     号：12、6、1）；兔抗大鼠 AKT1 单克隆抗体、兔抗大鼠
                      [3]
        挥抗纤维化效应 。本课题组前期研究发现，DN模型大                           p-AKT （Thr308） 单克隆抗体、小鼠抗大鼠β-actin 单克隆抗体
        鼠肾小管上皮细胞中 PTEN 表达水平显著降低，而采用                        （北京博奥森生物技术有限公司，批号：AD082821、
        胰岛素控制模型大鼠的血糖后，其肾小管上皮细胞中                             AG092722、AH03193074）；兔抗大鼠上皮钙黏素（E-cad-
        PTEN 的表达有所上调且 DN 进展得以延缓               [4-5] ，但是影    herin）多克隆抗体（北京博士德生物工程有限公司，批
        响 PTEN 表达的调控因素目前尚不清楚。有研究发现，                         号：12P24）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG
        过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）参与了对                           二抗、HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗（泰安普美生物
        PTEN表达的调控       [6-7] 。噻唑烷二酮类药物是PPARγ的选             科技有限公司，批号：028326、019215）；RIPA 强裂解液
        择性激动剂，其对抗转化生长因子β 1 （TGF-β 1 ）诱导的纤                  （北京索莱宝科技有限公司，批号：20180507）；ECL显色
                                         [8]
        维化的作用是通过活化 PPARγ实现的 ，且其可以显著                         剂（常 州 天 地 人 和 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 ：
                                                            2018060701）；SYBR Premix Ex Taq TM  Perfect Real-time
        减轻肾纤维化 。然而，噻唑烷二酮类药物是否通过
                     [9]
                                                            试剂盒（日本Takara公司，批号：BKA3002）；MTT细胞增
        PPARγ参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞中PTEN表达
                                                            殖及细胞毒性检测试剂盒（上海威奥生物科技有限公
        的调控，从而发挥抗 DN 肾小管间质纤维化的作用尚未
                                                            司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天生物研究
        完全阐明。因此，本研究拟通过观察噻唑烷二酮类药物
                                                            所）；TRIzol Reagent（RNA 提取试剂，美国 Initrogen 公
        吡格列酮（PIO）对高糖条件下大鼠近端肾小管上皮细胞
                                                            司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国 Millipore 公司）；二
        NRK-52E 中 PPARγ、PTEN 及 PI3K/AKT 信号通路表达
                                                            甲基亚砜（DMSO）等其余试剂均为分析纯或实验室常
        的影响，并通过PPARγ特异性拮抗剂GW9662进行反向
                                                            用规格，水为超纯水。
        验证，探讨PIO对高糖诱导的大鼠肾小管EMT的作用及
                                                            1.3  PCR引物
        可能机制，为DN的防治提供理论依据及新靶点。
                                                                PPARγ、PTEN、β-actin 引物由上海生工生物技术工
        1 材料
                                                            程服务有限公司设计、合成，引物序列及产物大小见表1。
        1.1  仪器
                                                                        表1 引物序列及产物大小
            BSA2202S 型电子天平（德国 Sartorius 公司）；AL-
                                                                 Tab 1 Primer sequence and product length
        LEGRA X-15R 型低温高速离心机、DU800 型核酸蛋白
                                                            基因名称           引物序列                      产物大小，bp
        分析仪（美国 Beckman 公司）；3111 型 CO2细胞培养箱、                 PPARγ          正义链：5′-CGCAGCCTCAGCCAAGAC-3′  145
        MultiskanFC 型全自动酶联免疫检测仪（美国 Thermo                                  反义链：5′-TGGGGAGAGAGGACAGATGG-3′
        Fisher Scientific公司）；CX33型倒置显微镜（日本Olym-             PTEN           正义链：5′-CAATGTTCAGTGGCGGAACTT-3′  153
                                                                           反义链：5′-GGCAATGGCTGAGGGAACT-3′
        pus公司）；DYCZ-24DN型迷你垂直电泳仪（北京六一生                      β-actin        正义链：5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′  108
        物科技有限公司）；ChemiDoc 型凝胶成像系统、CFX96                                    反义链：5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′
        型荧光定量 PCR 分析系统（美国 Bio-Rad 公司）；U33V                  1.4 细胞
        型超低温冰箱（日本 Sanyo 公司）；TY-80S 型摇床（常州                       大鼠近端肾小管上皮细胞株 NRK-52E 购自中国科
        市瑞华仪器制造有限公司）。                                       学院昆明细胞库（许可证号：KCB200815YJ）。
        1.2  药品与试剂                                          2 方法
            PIO 原料药（美国 Cayman 公司，批号：71745，纯度：               2.1 细胞培养和药物母液制备
                                                                                                      2
        99.0％）；PPARγ特异性拮抗剂 GW9662 原料药（美国                        复苏 NRK-52E 细胞，接种于培养瓶（25 cm 规格）
        Selleckchem 公司，批号：01，纯度：99.25％）；胎牛血清                中，用含有 10％FBS 的 DMEM 培养基，置于 37 ℃、5％


        ·1950 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16                                 中国药房    2020年第31卷第16期
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