Page 32 - 202015
P. 32

2.3 细胞毒性考察                                          孔，培养48 h。细胞培养完毕后，用PBS清洗3 min×2～
            采用 MTT 法测定索拉非尼、脱脂膏和 CⅡ-3 对                      3次，然后转移至1.5 mL离心管中，加入RIPA裂解液50
        HepG2/ADM 细胞的毒性。取对数生长期的 HepG2/                      μL（含蛋白酶抑制剂、磷酸化抑制剂），冰上孵育30 min，
        ADM细胞，以0.25％胰酶消化后，用常规培养基重悬制                         用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解；然后在4 ℃下以
                         5
        成细胞密度为 2×10 个/mL 的细胞悬液，按 100 μL/孔接                  20 000 r/min离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。采
        种到96孔板中，培养24 h。然后将细胞分为索拉非尼组                         用BCA法进行蛋白定量后，变性处理，再经十二烷基硫
        （2、4、8、16、32 μg/mL）、脱脂膏组（80、160、320、640、1 280       酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳分离，然后转入醋
        μg/mL）、CⅡ-3 组（10、20、40、80、160 μg/mL），每个质量           酸纤维素印迹膜上；以 5％脱脂奶粉封闭 2 h 后，加入
        浓度均设置6个复孔。另设空白对照组（含细胞但不含                            Bcl-2（1∶1 500）、Caspase-9/（1∶800）、GAPDH（1∶5 000）一
        药物）和试剂对照组（不含细胞和药物）。加药培养48 h                         抗，4 ℃下孵育过夜；以 TBST 洗膜 10 min×3 次，加入二
        后，弃去培养基，加入含 10％MTT（100 μL/孔）的培养                     抗（1∶500），室温下孵育2 h；以TBST洗膜6 min×3次，然
        基，继续培养 4 h；再加入 DMSO（100 μL/孔），振荡 30                 后置于凝胶成像仪中，以电化学法（ECL）显影。采用
        min，待紫色结晶完全溶解后，用全自动酶标仪在570 nm                       Image J 6.0 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带
        波长处测定各孔的吸光度（OD）值，计算细胞存活率[细                          与内参（GAPDH）蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白
        胞存活率（％）＝（给药组 OD 值－试剂对照组 OD 值）/                      的表达水平。
        （空白对照组OD 值－试剂对照组OD 值）×100％]，并采                      2.7  美洲大蠊提取物对 HepG2/ADM 细胞中 MDR 相
        用SPSS 17.0软件计算药物的20％抑制浓度（IC20 ）。                    关基因mRNA及其蛋白的影响考察
        2.4 细胞分组与给药                                         2.7.1 MDR 相关基因 mRNA 表达           采用实时荧光定
            试验共设置 5 个组，分别为敏感组、耐药组、索拉非                       量-PCR 法测定细胞中 MDR1、LRP、BCRP 的 mRNA 表
        尼组（阳性对照）、脱脂膏组和 CⅡ-3 组。敏感组加入                         达水平。取对数生长期细胞，0.25％胰酶消化后制成单
                                                                             5
        HepG2 细胞，其余 4 组均加入 HepG2/ADM 细胞。给药                  细胞悬液，按2.4×10 个/孔的细胞密度接种于6孔板中，
        时，敏感组和耐药组细胞加入常规培养基，其余3组分别                           培养24 h后，按“2.4”项下方法分组、给药，每组设置3个
        加入含相应药物的培养基（终质量浓度均为各自的                              复孔，培养48 h。细胞培养完毕后，用Trizol 试剂提取总
        IC20 ）。                                             RNA，验证其浓度和纯度，然后取总 RNA 2 μg，按 Bey-
        2.5  美洲大蠊提取物对 HepG2/ADM 细胞中药物累积                     oRT TM  Ⅱ cDNA 第一链合成试剂盒说明书操作合成 cD-
        的影响考察                                               NA，并以 cDNA 为模板采用两步法进行 PCR 扩增。反
            采用激光扫描共聚焦显微技术进行测定。取对数                           应 体 系（20 µL）：Beyo Fast  TM  SYBR Green qPCR Mix
        生长期的两种细胞，分别以 0.25％胰酶消化后，用常规                        （2×）10 µL，上、下游引物各2 µL，Template 2 µL、去核酸
        培养基制成单细胞悬液，按8×10 个/皿的细胞密度接种                         酶水 4 µL。反应程序：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15
                                    6
        于放有爬片的小皿中（直径 3 cm），摇匀，于培养箱中培                        s，60 ℃退火 30 s，40 个循环。引物序列：MDR1 上游引
        养24 h。细胞培养完毕后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，                       物序列为 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引
        然后按“2.4”项下方法进行分组、给药，每组设置10个复                        物序列为 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，扩增产
        孔。各组细胞培养 48 h 后，以 PBS 清洗，再加入含 5                     物大小为 226 bp；LRP 上游引物序列为 5′-GCTCATAG-
        μg/mL ADM的培养基，继续培养2 h；取出后用冷PBS清                     GATATGGGACACACT-3′，下游引物序列为 5′-CCAG-
        洗 5 min×3 次，加入 4％多聚甲醛避光固定 30 min；再用                 GAAATCAGTTGGTGAGAAT-3′，扩增产物大小为 121
        冷PBS清洗5 min×2次，加入DAPI核染5 min；然后用冷                   bp；BCRP 上游引物序列为 5′-GTTCTCAGCAGCTCTT-
        PBS 清洗 5 min×3 次；最后，用抗荧光淬灭封片剂封片，                    CGGCTT-3′，下游引物序列为 5′-TCCTCCAGACACA-
        避光保存，次日于激光共聚焦显微镜下拍照观察。镜下                            CCACGGATA-3′，扩增产物大小为268 bp；GAPDH上游
        ADM 阳性表达为红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。采用                           引物序列为 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下
        Image J 6.0 软件计算阳性细胞荧光强度值（荧光强度值                     游 引 物 序 列 为 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-
        越大表明药物含量越高）。                                        3′，扩增产物大小为 197 bp。以 GAPDH 为内参，采用
        2.6  美洲大蠊提取物对 HepG2/ADM 细胞中凋亡相关                     2 －ΔΔCt 法计算各目的基因的 mRNA 表达水平（式中 Ct 表
        蛋白的影响考察                                             示荧光信号强度达到设定阈值时经历的循环次数）。
            采用 Western blotting 法测定细胞中 Bcl-2、剪切型            2.7.2 MDR相关蛋白表达          采用免疫细胞化学染色法
        Caspase-9 p37（Cleaved-Caspase-9 p37）蛋白表达水平。         检测细胞中P-gp、LRP、BCRP蛋白表达水平。取对数生
                                                                                                6
        取对数生长期的两种细胞，分别以 0.25％胰酶消化后，                         长期细胞，以0.25％胰酶消化后，按2.4×10 个/孔的细胞
                                       5
        用常规培养基制成细胞密度为5×10 个/mL的单细胞悬                         密度接种于预置有爬片的12孔板中，待细胞贴壁生长良
        液，按 7.5×10 个/孔的细胞密度接种于 24 孔板中，培养                    好后，按“2.4”项下方法分组、给药，培养48 h。取出各组
                    5
        24 h 后，按“2.4”项下方法分组、给药，每组设置 3 个复                    长有细胞的爬片，以PBS漂洗2 min×3次；以4％多聚甲


        ·1818  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15                                中国药房    2020年第31卷第15期
   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37