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醛固定 30 min 后，将 3％ H2O2-甲醇混合液（1 ∶ 4，V/V）滴 150 150
在各组爬片上，室温孵育 30 min；以水洗 5 min×2 次，加 ％ 100 ％ 100
入 5％牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 10 min；加入 P-gp 细胞存活率， 细胞存活率，
（1 ∶ 500）、LRP（1 ∶ 400）、BCRP（1 ∶ 400）一抗，4 ℃下孵育 50 50
过夜；以PBS清洗2 min×3次，滴加二抗（1∶1 000），37 ℃ 0 0
0 1 2 4 8 16 40 80 160 320 640 1 280
下孵育 30 min；以 PBS 清洗 2 min×3 次，用 DAB 显色试 质量浓度，μg/mL 质量浓度，μg/mL
A.索拉非尼 B.脱脂膏
剂盒显色（棕色）后加入水终止反应；用水清洗 5 min×3
150
次，加入苏木素复染40 s；将标本放入饱和Na2HPO4溶液
％
中浸泡 2 min，取出后立即用水清洗 5 min×3 次；用乙醇 100
梯度（50％、75％、85％、95％、100％）脱水，甘油封片。 细胞存活率， 50
光镜下观察各组细胞中 P-gp、LRP、BCRP 蛋白表达情
0
况，以细胞核有明显棕色或棕黄色颗粒为阳性表达。采 0 10 20 40 80 160
质量浓度，μg/mL
用Image J 6.0软件计算阳性细胞的平均光密度值。 C. CⅡ-3
2.8 美洲大蠊提取物对 HepG2/ADM 细胞中酶介导 图1 各组细胞的存活率测定结果（n＝6）
MDR途径中相关基因mRNA及其蛋白的影响考察 Fig 1 Survival rate of cells in each group（n＝6）
2.8.1 对酶介导MDR途径中相关基因mRNA表达的影
响 参照“2.7.1”项下方法测定细胞中 TopoⅡ、GST-π
mRNA 表达水平。其中，GST-π上游引物序列为 5′-
AGTCTCCTCGGTTCCCAAGCAA-3′，下游引物序列为 敏感组
5′-GGTGCTGGTTAAAGAGTTCGCC-3′，扩增产物大
小为132 bp；TopoⅡ上游引物序列为5′-TTAATGCTGC-
GGACAACAAACA-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CGAC-
CACCTGTCACTTTCTTTT-3′，扩增产物大小为217 bp；
其余试验条件均与“2.7.1”项下相同。 耐药组
2.8.2 对酶介导MDR途径中相关蛋白表达的影响 参
照“2.7.2”项下方法检测细胞中Topo Ⅱ、GST-π蛋白表达
水平。其中，一抗的稀释比例均为1∶200；其余试验条件
均与“2.7.2”项下相同。
2.9 统计学方法 索拉非尼组
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资
料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组
间比较采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞毒性考察结果 CⅡ-3组
3种药物分别作用48 h后，均对HepG2/ADM细胞生
长有抑制作用，且均呈一定的浓度依赖性趋势。索拉非
尼、脱脂膏、CⅡ-3的IC20分别为（2.40±0.16）、（200.44±
27.52）、（18.00±1.82）μg/mL，三者间差异均具有统计学
意义（P＜0.01）。各组细胞的存活率测定结果见图1。
3.2 美洲大蠊提取物对细胞药物累积的影响 脱脂膏组
给药48 h后，与敏感组比较，耐药组细胞中ADM含
量差异无统计学意义（P＞0.05）。与耐药组比较，索拉
DAPI ADM Merge
非尼组、脱脂膏组、CⅡ-3 组细胞中 ADM 含量均显著增
注：图中箭头所指为ADM在细胞中的位置
加（P＜0.05）。3 个给药组间比较，细胞中 ADM 含量差 Note：the arrow in the picture refers to ADM location in the cells
异均无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞的共聚焦激光 图2 各组细胞的共聚焦激光扫描显微图（×400）
扫描显微图见图2（其中，Merge图为融合荧光叠加图）， Fig 2 Laser scanning confocal micrograms of cells in
细胞中ADM含量测定结果见表1。 each group（×400）

中国药房 2020年第31卷第15期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15 ·1819 ·