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0.05 or P＜0.01）；the protein expression of Bcl-2 and the mRNA expression of Topo Ⅱ were significantly decreased（P＜0.01），
while the protein expression level of Cleaved-Caspase-9 p37 was significantly increased in C Ⅱ -3 group （P＜0.05）.
CONCLUSIONS：Degreasing cream and CⅡ-3 can reverse multidrug resistance of HepG2/ADM cells by reducing drug efflux，
promoting cell apoptosis，reducing the mRNA and protein expression of multi-drug resistance gene as well as gene in
enzyme-mediated multi-drug resistance pathway. The effect of CⅡ-3 is better than that of degreasing cream.
KEYWORDS Periplaneta americana；Degreasing cream；CⅡ-3；Hepatocellular carcinoma；Multi-drug resistance；HepG2/ADM
cells；Mechanism

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居 台式低速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；
全球癌症中的第 3 位，具有“癌中之癌”之称 [1-2] 。目前， CKX31型倒置光学显微镜（日本Olympus公司）。
临床除化疗外，常采用手术治疗、放疗、生物治疗等多种 1.2 药品与试剂
方法联合治疗肝癌，但治疗效果仍不显著，这主要是由 脱脂膏（褐色黏稠膏状，批号：P14805-20171023，得
于肿瘤细胞容易对化疗药物产生多药耐药（MDR），使药 率 ：约 75.18％）和 C Ⅱ -3（黄 褐 色 冻 干 粉 末 ，批 号 ：
[3]
物疗效降低 。药物产生MDR的机制复杂，现已明确的 17102125，得率：约 0.2％）均由云南省昆虫生物医药研
主要包括影响凋亡相关蛋白、耐药相关蛋白的表达以及 发重点实验室制备 [12-13] ；ADM（含量：98.0％～102.0％）、
TM
产生MDR相关蛋白促进药物外排等 [4-5] 。临床上常通过 BeyoRT Ⅱ cDNA 第一链合成试剂盒、二喹啉甲酸
使用 P-糖蛋白（P-gp，基因 MDR1 的表达产物）抑制剂来 （BCA）蛋白测定试剂盒、4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）
减少化疗药物的MDR，但由于药物的毒性、相互作用及 染色液均购自碧云天生物技术有限公司；胎牛血清
作用机制单一等多种因素使其效果并不显著。中药逆 （FBS，美国 Gibco 公司，批号：2166446）；青链霉素双抗
转肿瘤耐药性具有多途径、多环节、多靶点的独特优势， （批号：20190909）、索拉非尼原料药（批号：28154，纯
[6]
具有较好的开发潜力 。 度：≥99.0％）均购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM
美洲大蠊（Periplaneta americana L.）又称“蟑螂”， 培 养 基（上 海 生 工 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 ，批 号 ：
具有极强的生命力，并具有抗炎、镇痛、抗氧化、减轻肝 F909FA0001）；兔源 B 细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）、胱天蛋白
损伤、抗肿瘤等多种药理作用 [7-8] 。本课题组前期研究表 酶 9（Caspase-9）、P-gp、肺耐药蛋白（LRP）、乳腺癌耐药
明，美洲大蠊提取物脱脂膏（美洲大蠊干燥虫体经 70％ 相关蛋白（BCRP）、谷胱甘肽转移酶（GST-π）、DNA拓扑
乙醇冷浸提取3次，合并、浓缩提取液后得浸膏，再将浸 异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）多克隆抗体（美国Proteintech公司）；
膏去除油脂后得到的褐色黏稠亮状物称为“脱脂膏”）和 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美国
CⅡ-3（浸膏经聚酰胺柱洗脱浓缩，冷冻干燥后得到的黄 Abcam 公司，批号：ab6721）；其余试剂均为分析纯或实
褐色冻干粉末称为“CⅡ-3”）均具有抑制肿瘤生长、逆转 验室常用试剂，水为双蒸水。PCR试验中mRNA引物均
肝癌细胞MDR等作用 [9-11] ，但其作用机制尚未明确。因 由上海生工生物工程股份有限公司合成。
此，本研究拟采用人肝癌细胞株 HepG2 和耐阿霉素 1.3 细胞
（ADM）人肝癌细胞株HepG2/ADM为试验对象，以索拉 人肝癌细胞株HepG2和人肝癌耐药细胞株HepG2/
非尼作为阳性对照，分别从细胞内药物累积和细胞凋 ADM均由江苏齐氏生物科技有限公司提供。
亡、耐药相关蛋白表达及酶介导 MDR 途径中相关基因 2 方法
和 蛋 白 表 达 等 方 面 深 入 探 讨 脱 脂 膏 和 C Ⅱ -3 逆 转 2.1 细胞培养
HepG2/ADM细胞MDR的机制，旨在为美洲大蠊相关产 分别将 HepG2、HepG2/ADM 细胞接种于含 10％
品进一步研发提供参考。 FBS 和 1％青链霉素双抗的 DMEM 培养基中，在 37 ℃、
1 材料 5％CO2培养箱中培养（下同）。其中，HepG2/ADM 细胞
1.1 仪器 的培养基中加入 0.5 μg/L 的 ADM，以维持细胞的耐药
TCS SP8 型激光共聚焦显微镜（德国 Leica 公司）； 性。两种细胞均每1～2天更换1次培养基，待细胞长满
BB16UV/BB5060UV 型 垂 直 流 超 净 工 作 台 、BSC- 培养瓶 80％以上时进行传代，采用对数生长期（第 3～5
1000ⅡA2 型二级生物安全柜（苏州安泰空气技术有限 代）的细胞进行试验。
公司）；DSR-22 型数控摇床振荡器（江苏康健医疗用品 2.2 药液的制备
有限公司）；SN255939 型全自动酶标仪、3111 型 CO2培 将脱脂膏、CⅡ-3分别用生理盐水制备成20 mg/mL
养箱（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；785BR15145 （均按生药量计，下同）的母液，以微孔滤膜滤过除菌后，
型 聚 合 酶 链 式 反 应（PCR）仪（美 国 Bio-Rad 公 司）； 于4 ℃保存，备用。试验时再用生理盐水稀释到所需质
BSA24S 型电子分析天平（德国 Sartorius 公司）；TD3 型 量浓度。

中国药房 2020年第31卷第15期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15 ·1817 ·