Page 45 - 202012
P. 45

tissue，which were mainly attributed to the metabolism of arginine，energy and nucleic acid. CONCLUSIONS：The antitumor
        effect of CⅡ-3 may be related to the regulation of arginine metabolism，energy metabolism and nucleic acid metabolism.
                                                                         1
        KEYWORDS    Periplaneta americana extract CⅡ-3；MFC cell line；Metabolomics；H-NMR；Mice
            恶性肿瘤的病死率高、患者预后差，严重威胁人类                         NaH2PO4、甲醇等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
        健康，给患者及其家属带来了严重的经济和精神负担。                           1.3 细胞
        胃癌是世界上较为严重的恶性肿瘤之一，其病死率位居                               MFC 细胞取自 615 小鼠胃癌组织，呈贴壁生长，购
                  [1]
        全球第3位 。目前，对于肿瘤的治疗方法以传统化疗、                          自中国科学院细胞库。
        放疗和手术等为主，但传统放化疗方法疗效有限，且毒                           1.4 动物
        副作用较大，可造成机体免疫监视和免疫防御减弱                                 SPF 级 Balb/c 小鼠，雌性 8 只、雄性 4 只，6～8 周龄，
          [2]
        等 。因此，寻找新的肿瘤治疗药物显得尤为迫切。                            体质量20 g左右，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公
            近年来，代谢组学作为一种新兴的组学技术，已成                         司，动物使用许可证号：SYXK（湘）2016-0002。所有小
        功地应用于各种系统生物学研究领域，通过分析疾病治                           鼠均饲养于大理大学清洁级实验室内，给予标准饮食和
        疗过程中生物体内发生的代谢物和代谢通路改变，从整                           清洁用水，在平均温度为（20±2）℃、相对湿度为（55±
                                   [3]
        体角度研究生物体的功能水平 。核磁共振（NMR）技                          5）％条件下适应性喂养1周。
        术具有高通量、无创性以及重现性好、前处理简单等优                           2 方法
          [4]
                               1
        点 ，以氢-1核磁共振技术（H-NMR）为基础的代谢组学                       2.1 MFC细胞体外培养
                                                               取 MFC 细胞，常规复苏，用含 10％FCS 的 RPMI
        技术已广泛应用于癌症生物标志物的鉴定、监测以及抗
                    [5]
        癌药物的研发 。                                           1640完全培养基于37 ℃、5％CO2条件下培养；取对数生
            美洲大蠊[Periplaneta americana（L.）]为昆虫纲蜚蠊          长期的细胞，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）调整细胞密
                                                           度至1×10 mL ，备用。
                                                                        －1
                                                                    7
        目蜚蠊科昆虫的干燥全体。现代药理研究表明，美洲大
                                                           2.2  分组、造模与给药
        蠊在抗肿瘤、增强机体免疫、护肝、促进组织修复和抗菌
                                                               将小鼠随机分为模型组和CⅡ-3组，每组6只（雌性
        等方面均具有较强的作用 。美洲大蠊提取物CⅡ-3是
                              [6]
                                                           4只、雄性2只），用75％乙醇消毒小鼠右侧腋下，棉球擦
        从美洲大蠊粉末中提取的以肽类为主的混合物 。本课
                                                [2]
                                                           干后皮下注射“2.1”项下MFC细胞悬液0.2 mL，于接种后
        题组前期的研究表明，CⅡ-3对小鼠胃癌细胞MFC的生
                                                           次日开始给药，给药剂量依据前期研究设置，模型组小
        长具有一定的抑制作用 ，但其抗肿瘤物质基础及作用
                            [2]
                                                           鼠灌胃等体积生理盐水，CⅡ-3 组小鼠灌胃 CⅡ-3（200
        机制尚需深入探讨。基于此，本研究从代谢组学角度出
                                                           mg/kg），给药体积均为20 mL/kg，每日1次，连续10 d。
        发，借助 H-NMR技术对比分析给予CⅡ-3前后MFC荷
               1
                                                           2.3  样品的收集与处理
        瘤小鼠肝组织中的内源性差异性代谢物，探索CⅡ-3对
                                                               末次给药 24 h 后，颈椎脱臼处死各组小鼠，迅速剥
        MFC 荷瘤小鼠的潜在抑瘤作用机制，以期为进一步
                                                           离瘤体，测量大小，并分离肝组织。取肝组织0.1 g，加入
        明确 CⅡ-3的抑瘤机制提供参考。
                                                           67％冰甲醇中，匀浆，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10
        1 材料
                                                           min，取上清液，真空浓缩4 h，冷冻干燥24 h，制成冻干粉，
        1.1  仪器
                                                           再加入 0.1 mol/L K2HPO4/NaH2PO4 缓冲液（pH 7.4）650
            Ascend 800 MHz NMR 仪（瑞 士 Bruker 公 司）；
                                                           μL，涡旋混匀，在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上
        MCO-18AIC 型 CO2 培养箱（日本 Sanyo 公司）；Miccra            清液550 μL，置于－80 ℃冰箱保存，用于 H-NMR检测。
                                                                                             1
        D-1 型组织破碎仪[迈卡莱客（广州）工业技术有限公                         2.4  1 H-NMR图谱采集与分析
        司]；Sigma 3-15 型低温高速离心机（希格玛实验室离心                        采用 NMR 仪采集各组每只小鼠的肝图谱，谱宽为
        机公司）；Labconco CentriVap 型真空离心浓缩仪（北京                20 ppm，采样点数为 32 K，采样时间为 1.64 s，累计 64
        照生行仪器设备有限公司）；GOLD-SIM 型冷冻干燥                        次。所有图谱均采用Topspin 3.1软件进行傅里叶转换，
        机[金西盟（北京）仪器有限公司]。                                  并进行手动相位、基线校正，以 3-（三甲基甲硅烷基）氘
        1.2 药品与试剂                                          代丙酸钠（TSP）[化学位移（δ）＝0]为标准对谱图进行化
            CⅡ-3由大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实                        学位移的校正。应用 AMIX 3.8 软件去除水峰区域，并
        验室提供，经鉴定其中 66％～67％为小分子肽类物质；                        对图谱进行分段积分，将产生的所有积分数据进行归一
        RPMI 1640 完全培养基、胎牛血清（FCS）均购自美国                     化处理。归一化后的数据导入SIMCA-P 13.0软件，进行
        Gibco 公 司 ；生 理 盐 水 由 本 实 验 室 自 制 ；K2HPO4、          多元统计分析，包括非监督型主成分分析（PCA）、监督


        中国药房    2020年第31卷第12期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 12  ·1447  ·
   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50