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度为 10 mg/mL，以生理盐水配制；给药量为 100 mg/kg，                DESeq V3.10 软件对各组基因表达量（以经 FRKM 进行
        剂量根据该药临床用量并按人与动物体表面积换算而                            标准化的Reads值表示）进行差异分析，以表达差异倍数
        得），A、B 组大鼠均腹腔注射等容生理盐水。首次给药                         log2FC＞1且P＜0.05的基因为DEGs         [13-14] ，并绘制各组间
        应在术后30 min内，每日1次，分别持续7 d或14 d。                     共有、特有DEGs的Upset图。
        2.3 大鼠神经功能行为学观察及评分                                 2.5 生物学分析
            分别于造模前和造模后 7、14 d 时对各组大鼠进行                         以“2.4”项下所得 DEGs 为对象，借助 GO 数据库
        BBB评分：将大鼠放入开口圆盆中，使其自由直线行走，                         （http：//geneontology.org/）中的“topGO”插件进行 GO 富
        尽量令其在盆内的中心区域活动。测试时间为 4 min，                        集分析，挖掘 DEGs 涉及的生物学过程（BP）、细胞组分
        观察大鼠在行走过程中膝、髋和踝关节的运动幅度、躯                           （CC）和分子功能（MF）；借助KEGG数据库（http：//www.
        干运动和协调情况并计分；总分为21分，分数高低与大                          kegg.jp/）进行 KEGG 通路富集分析，挖掘 DEGs 富集的
        鼠 SCI 程度呈反比 。评分由两位研究者独立完成，取                        主要信号通路。两者均以P＜0.05为显著富集。
                        [10]
        平均值作为评分结果。                                         2.6 统计学方法
        2.4 标本的采集与指标检测                                         采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资
        2.4.1  标本的采集      分别于造模后 7、14 d 时取 B、C 组           料以x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有
        大鼠各6只，于造模后14 d时取A组大鼠6只，均于耳缘                        统计学意义。
        静脉注射 30 g/L 戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉后，于                 3 结果
        左心室灌注生理盐水约 30 mL，再用 4％多聚甲醛溶液
                                                           3.1 大鼠BBB评分结果
        30 mL灌注至肢体强直，以脊髓受损处（A组大鼠于对应
                                                               造模前，各组大鼠的 BBB 评分均为 21 分。与 A 组
        位置）为中心，取出上下各长约0.5 cm的脊髓，备用。                        比较，B 组大鼠造模后 7、14 d 时的 BBB 评分均显著降
        2.4.2 HE、尼氏染色观察         每组在相应时间点取3只大
                                                           低；与 B 组比较，C 组大鼠造模后 7、14 d 时的 BBB 评分
        鼠的脊髓标本适量，置于4％多聚甲醛溶液中固定过夜，
                                                           均显著升高（P＜0.05），详见表1。
        次日经常规脱水、透明、石蜡包埋后切片（厚度约 4
                                                               表1    各组大鼠BBB评分比较（x±±s，n＝6，分）
        μm）。切片分别经HE、尼氏染色后，置于显微镜下观察
                                                           Tab 1  Comparison of BBB score of rats in each group
        并拍照，记录大鼠脊髓损伤及恢复情况[经 HE 染色后，
                                                                 （x±±s，n＝6，score）
        神经细胞的细胞质呈红色，细胞核呈蓝紫色；经尼氏染
                                                           组别                造模后7 d              造模后14 d
        色后，尼氏体呈块状（如虎斑状）或颗粒状]。
                                                           A组                  21                  21
        2.4.3 DEGs 分析    每组在相应时间点取另外 3 只大鼠                 B组                6.42±1.11 ＊         10.08±1.28 ＊
        的脊髓标本适量，采用 Ambion Trizol 试剂盒提取总                    C组                10.25±0.69 #        12.83±1.21 #
        RNA，选择质量合格[即经生物分析仪检测，RNA完整值                            注：与A组比较，P＜0.05；与B组比较，P＜0.05
                                                                                         #
                                                                          ＊
                                                                           ＊
                                                                                          #
                                                  [11]
       （RIN）≥7；28S/18S≥1.5，且起始量为 0.1～1 μg] 的总                  Note：vs. group A，P＜0.05；vs. group B，P＜0.05
        RNA 作为 mRNA 测序的建库起始样品，经 mRNA 纯化                    3.2  HE、尼氏染色观察结果
        及片段化、cDNA合成、文库片段富集、文库质检后，采用                            经HE染色后，A组大鼠脊髓神经细胞形态正常，胞
        二代转录组测序技术以高通量转录组测序仪对上述文                            核清晰可见；B组大鼠脊髓神经细胞核固缩，且数量明显
        库进行双末端（PE）测序。使用Cutadapt v1.15软件对原                  减少；C组大鼠脊髓神经细胞破损程度较同一时间点的
        始数据进行处理，去除 3′端带接头的序列、平均质量分                         B 组要轻，详见图 1A。经尼氏染色后，A 组大鼠尼氏体
        数低于 Q20 的序列，以保证测序错误率＜1％；使用                         呈块状（形如虎斑）或颗粒状；B组大鼠尼氏体染色变浅，
        FastQC v0.11.8 软件对测序数据进行单碱基质量分布、                   数量明显减少，在7 d时几乎消失；C组大鼠尼氏体的数
        含量分布、Reads值平均质量分布检测，以评估测序数据                        量较同一时间点的B组明显增多，详见图1B。
        的质量；使用 HISAT 2.0 软件将过滤后的 Reads 值与 En-              3.3 DEGs分析结果
        sembl数据库（http：//www.ensembl.org/）中的参考基因组               测序所得数据的质量检测结果显示，大部分序列的
       （共有基因 22 250 个）进行对比。根据比对结果，使用                       碱基质量均在 Q20 以上，未出现碱基偏移；中等表达的
        HTSeq v0.11.1软件统计各比对基因的Reads值，并将该                  基因占大多数，而低表达、高表达的基因占比较小，见图
        值作为此基因的原始表达量。使用 FPKM（Fragments                     2[图中，A、B、C分别对应A、B、C组，数字对应各组大鼠
        per kilobase million，即在每百万个Reads值中，来自某基            序号，“7 d”“14 d”分别表示造模后 7 d、造模后 14 d（下
        因每千个碱基长度的Reads值）对表达量进行标准化，使                        同）；盒型中间的横线是中位数，盒型的上下边缘为75％
        用 RSeQC v2.6.4 软件分析表达量饱和度，并以 Pearson               lgFRKM，上下限为90％lgFRKM]；样本间基因表达模式
        相关系数表示样本间基因表达模式的相关性，并制作成                           的Pearson相关系数均大于0.8，提示各样本选择合理、生
        热图（重复样本间的相关系数越接近于1，表明相关性越                          物重复性较好，见图 3（图中，左侧和上侧为样本聚类情
        强 ）。在此基础上，对不同样本进行表达分析，采用                           况，方块中的数据为Pearson相关系数）。
          [12]

        中国药房    2020年第31卷第11期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11  ·1329  ·
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