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（0.1％DMSO），每组均按 1 mL/孔加入相应溶液。加药
完毕后，将 24 孔板用锡纸遮光，置于温度 28.5 ℃、光照
SIVs
（14 h）/黑暗（10 h）交替的环境下培养。培养 48 h 后，在
出芽SIVs
荧光显微镜下观察各组斑马鱼SIVs数。
SIVs
2.4 TB-ⅡⅡ对PTK787诱导的血管损伤斑马鱼体内相关
因子mRNA表达的影响考察
采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。将 24 hpf 的
斑马鱼胚胎用胰蛋白酶进行脱膜处理后，在体视显微镜
A.空白对照组 B. TB-Ⅱ 100 μg/mL组
下随机暴露于24孔板中，每孔16个胚胎。实验分组、给
药及培养情况同“2.3”项。培养48 h后，每孔随机抽取3
SIVs
条斑马鱼，按照 Trizol 试剂说明书操作提取斑马鱼总
RNA，再按逆转录试剂盒说明书方法逆转录合成 cD- SIVs
NA，并以 cDNA 为模板采用两步法进行 PCR 扩增。扩
增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火和
延伸 34 s，39 个循环；反应体系：cDNA（稀释 5 倍）5 μL，
SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）10 μL，上、下游
C. TB-Ⅱ 200 μg/mL组 D. TB-Ⅱ 400 μg/mL组
引物各 0.5 μL，ddH2O 4 μL，共 20 μL。以甘酒醛-3-磷酸
图 1 TB-ⅡⅡ对正常斑马鱼血管新生影响的荧光显微图
脱氢酶（GAPDH）为内参基因，采用 2 －ΔΔc t 法计算各目标
（×100）
基因的相对表达量。引物序列及产物长度详见表1。
Fig 1 Fluorescence micrograph of the effects of TB-
表1 引物序列及产物长度
Ⅱ on vascular angiogenesis of normal zebrafish
Ⅱ
Tab 1 Primer sequence and product length
（×100）
基因名称 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp
GAPDH 上游：GATACACGGAGCACCAGGTT 80 表 2 TB-ⅡⅡ对正常斑马鱼 SIVs 数和 SIVs 出芽数的影
下游：AATACCAGCACCAGCGTCAA 响（n＝16）
Flt-1 上游：GAGTCACGTCCACCCACAAT 100 Tab 2 Effects of TB- ⅡⅡ on SIVs number and SIVs
下游：GCTTCGCCAACTGTCAGAAC
Kdr 上游：GGTGCATCTCCATATCCGGG 140 sprouting vessel number of normal zebrafish
下游：AAAGGTCGATCAAGCCAGCA （n＝16）
Kdr-1 上游：GATGCCCGGCGAAACAAAAT 99
组别 SIVs数，条 SIVs出芽数，条
下游：TACGACCAGCACACCAAGTC 空白对照组 8.176±0.300 0.125±0.125
VEGF-A 上游：CAACGCGTATCGCAGCATAA 113 TB-Ⅱ 100 μg/mL组 9.250±0.393 1.063±0.382 ＊
下游：CATCTTGGCTTTTCACATCTTTCT
TB-Ⅱ 200 μg/mL组 9.700±0.325 ＊＊ 0.188±0.136
TNF-α 上游：GGAGAGTTGCCTTTACCGCT 145 TB-Ⅱ 400 μg/mL组 9.250±0.335 0.563±0.223
下游：CCTGGGTCTTATGGAGCGTG
＊
＊＊
IL-6 上游：TCCTCAAACCTTCAGACCGC 78 注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
下游：TCAGGACGCTGTAGATTCGC Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
2.5 统计学方法 减少（P＜0.01），表明血管损伤斑马鱼模型造模成功。
采用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。计量资 与模型对照组比较，TB-Ⅱ 200、400 μg/mL 组斑马鱼
料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差 SIVs数显著增加（P＜0.01），表明TB-Ⅱ对斑马鱼血管损
齐性时组间两两比较采用 Dunnett 检验，方差不齐性时 伤具有明显的改善作用（P＜0.01），结果详见图2、表3。
组间两两比较采用 Dunnett’s T3 检验。P＜0.05 表示差 3.3 TB-ⅡⅡ对血管损伤斑马鱼体内 Flt-l、Kdr、Kdr-l、
异具有统计学意义。 VEGF-A mRNA表达的影响
3 结果 与空白对照组比较，模型对照组斑马鱼体内 Flt-l、
3.1 TB-ⅡⅡ对正常转基因斑马鱼血管新生的影响 Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相对表达量显著降低（P＜
与空白对照组比较，TB-Ⅱ 100 μg/mL 组斑马鱼 0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，TB-Ⅱ 100 μg/mL
SIVs出芽数显著增加（P＜0.05），TB-Ⅱ 200 μg/mL组斑 组斑马鱼体内Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相对表达量
马鱼 SIVs 数显著增加（P＜0.01），提示 TB-Ⅱ具有促进 显著升高（P＜0.05或P＜0.01），但Flt-l mRNA的相对表
斑马鱼血管新生的作用，结果详见图1、表2。 达量差异无统计学意义（P＞0.05）；TB-Ⅱ 200、400 μg/mL
3.2 TB-ⅡⅡ对血管损伤斑马鱼血管新生的影响 组斑马鱼体内 Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA 的相对
与空白对照组比较，模型对照组斑马鱼SIVs数显著 表达量均显著升高（P＜0.01），结果详见表4。

中国药房 2020年第31卷第7期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7 ·813 ·