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vascular injury model zebrafish increased to different extents；relative expressions of Flt-l，Kdr，Kdr-l，VEGF-A，TNF-α and IL-6
        mRNA were increased to different extents. There was no significant difference in SIVs number and the expression of Flt-l，TNF-α
        mRNA in zebrafish treated with 100 μg/mL TB-Ⅱ and the expression of TNF-α mRNA in zebrafish treated with 400 μg/mL TB-Ⅱ，
        but there was statistical significance in other indexes （P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS：TB-Ⅱ has a certain function of
        promoting angiogenesis and repairing damaged blood vessels，and its mechanism is related to the up-regulation of vascular
        endothelial growth factor receptor and pro-inflammatory cytokine expression.
        KEYWORDS Timosaponin BⅡ；Vascular protection；Zebrafish；Subintestinal veins；Mechanism


            知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloi-             （批 号 ：A0625AS，纯 度 ：＞98％）；胰 蛋 白 酶（批 号 ：
        des Bge.）的根茎 ，始载于《神农本草经》，性寒，味苦，具                    19030710，纯度：≥99％）均购自大连美仑生物技术有限
                      [1]
        有滋阴降火、止渴除烦等药理作用，是中医临床常用的                            公司；RNA 抽提试剂 Trizol（美国 Invitrogen 公司，批号：
                 [2]
        传统药物 。知母皂苷 BⅡ（TB-Ⅱ）作为知母的主要活                         15596026）；PCR反应试剂盒、逆转录试剂盒（日本Taka-
                                 [4]
                        [3]
        性成分，具有抗炎 、抗病毒 、抗癌 等多种药理活性。                          ra 公司，批号分别为 RR420AA、2641A-1）；二甲基亚砜
                                       [5]
        Guo CR 等 在细胞层面的研究发现，TB-Ⅱ具有防止糖                      （DMSO）、异丙醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱（广州化
                 [6]
        尿病心血管并发症的潜力，可能具有心血管保护作用。                            学制剂总厂，均为分析纯）；PCR引物由深圳优迪生物技
        但关于TB-Ⅱ的血管保护作用在体内动物模型层面并未                           术有限公司设计合成；水为自制养殖水。
        被证实，并且在基因层面，TB-Ⅱ的血管保护作用机制也                          1.3 动物
        不明确。目前，血管保护药物的筛选模型多为体外试                                 成年荧光转基因斑马鱼Tg（fli1：EGFP），雌雄兼有，
        验，其结果需要借助体内模型验证和评价。斑马鱼是一                            购自中国斑马鱼资源中心。斑马鱼饲养于循环水产养
        种优良的脊椎动物模型，借助具有快速筛选、高通量化、                           殖系统中，水温控制在（28.5±1.0）℃、pH 为 6.9～7.5、
        与人的遗传物相似度高等优点的转基因斑马鱼来作为                             光照（14 h）/黑暗（10 h）周期交替，每天喂食3次盐水虾。
                                       [7]
        药物筛选模型，得到了广泛的关注 。而且在斑马鱼发                            2 方法
        育过程中，其肠下静脉血管（SIVs）区域是一个光滑的篮                         2.1  斑马鱼胚胎的培养与收集
                                                    [8]
        网形结构，在发育初期清晰可见，利于观察和统计 ，已                               在繁殖的前一天晚上，将雌雄斑马鱼按照1 ∶ 1的比
        成为血管研究的重要模型 。因此，本研究以荧光转基                            例放入繁殖盒中，使用隔板将不同性别的斑马鱼隔开。
                               [9]
        因斑马鱼Tg（fli1：EGFP）为体内模型动物，探究TB-Ⅱ的                    次日清晨，将繁殖隔板拆掉，在灯亮（光照强度 54～324
        血管保护作用，并利用实时荧光定量-聚合酶链式反应                            lux）条件下 30 min 内，由斑马鱼自然交配，自然产生斑
        （PCR）法检测不同质量浓度TB-Ⅱ对斑马鱼体内fam样                        马鱼胚胎。收集斑马鱼胚胎，用水清洗多次，转入干净
        酪氨酸激酶 1（Flt-l）、含激酶插入区受体（Kdr）、含激酶                    的培养皿中，即获得了实验所需的斑马鱼胚胎。
        插入区受体 1（Kdr-l）、血管内皮生长因子 A（VEGF-A）、                  2.2  TB-ⅡⅡ对正常斑马鱼血管新生的影响考察
        肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素 6（IL-6）的 mRNA                      将受精后24 h（24 hpf）的斑马鱼胚胎用胰蛋白酶进
        表达，从而探究TB-Ⅱ保护血管的可能机制，为TB-Ⅱ血                         行脱膜处理后，在体视显微镜下将其随机暴露于24孔板
        管保护作用的进一步开发研究奠定基础。                                  中，每孔 16 个胚胎。实验设置 TB-Ⅱ不同质量浓度组
        1 材料                                               （100、200、400 μg/mL，以水为溶剂制备）和空白对照组
        1.1  仪器                                            （水），每孔加入相应溶液1 mL。加药完毕后，将24孔板
            Z-A-S5型斑马鱼养殖单元（上海海圣生物实验设备                       用锡纸遮光，置于温度 28.5 ℃、光照（14 h）/黑暗（10 h）
        有限公司）；SZ780型连续变倍体视显微镜（重庆奥特光                         交替的环境下培养。培养48 h后，在荧光显微镜下观察
        学仪器有限公司）；CFX96 型实时荧光定量-PCR 仪（伯                      各组斑马鱼SIVs数和SIVs出芽数。
        乐生命医学产品有限公司）；ZXSD-A1090型生化培养箱                       2.3 TB-ⅡⅡ对PTK787诱导的血管损伤斑马鱼血管新生
        （上海智诚分析仪器制造有限公司）；DMi8 型荧光显微                         的影响考察
        镜（德国 Leica 公司）；CP225D 型十万分之一电子天平                        将 24 hpf 的斑马鱼胚胎用胰蛋白酶进行脱膜处理
        （北京赛多利斯仪器系统有限公司）；1424R型低温冷冻                         后，在体视显微镜下随机暴露于24孔板中，每孔16个胚
        离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；K2800型微量分                         胎。采用酪氨酸激酶抑制剂PTK787诱导斑马鱼肠下血
        光光度计（北京凯奥科技有限公司）。                                   管损伤模型。实验设置 TB-Ⅱ不同质量浓度组（100、
        1.2  药品与试剂                                          200、400 μg/mL TB-Ⅱ溶液+0.06 μg/mL PTK787 溶液，
            TB-Ⅱ对照品（西安汇林生物科技有限公司，批号：                        DMSO 终 浓 度 为 0.1％）、模 型 对 照 组（0.06 μ g/mL
        18041004，纯度：≥98％）；酪氨酸激酶抑制剂 PTK787                   PTK787 溶液，DMSO 终浓度为 0.1％）和空白对照组


        ·812  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7                                   中国药房    2020年第31卷第7期
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