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Cleaved-Caspase-3 蛋白的相对表达量均显著升高、Cas-                研究较少。本研究结果表明，不同浓度马钱苷对HepG2
        pase-3 蛋白的相对表达量均显著降低（P＜0.05 或 P＜                    细胞增殖均具有抑制作用，且其抑制作用随马钱苷浓度
        0.01）；马钱苷中、高浓度组细胞中 Cleaved-Caspase-9 蛋              增加呈现增大的趋势。通过 Hoechst 33342 荧光染色法
        白的相对表达量均显著升高、Bcl-2 和 Caspase-9 蛋白的                  与流式细胞术分析发现，不同浓度的马钱苷均能显著诱
        相对表达量均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。各组细                     导HepG2细胞凋亡，同时将细胞周期阻滞于S期。
        胞中凋亡相关蛋白表达电泳图详见图 5，相对表达量详                               Cyclin D1是高度保守的细胞周期家族基因，能够调
        见表4。                                                控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）从而协调细胞增
                                                              [26]
                                                            殖 ，其在细胞周期过程中主要调控细胞周期G1/S期 。
                                                                                                         [27]
                 Bcl-2                          20 kDa
                                                            有研究表明，Cyclin D1在肝癌、乳腺癌、膀胱癌中呈过表
                                                            达 [28-29] ，从而改变细胞周期进程，促使肿瘤发生。PCNA
              Caspase-3                         35 kDa
                                                            是反映细胞增殖状态的良好指标，能够促进肿瘤细胞的
                                                                     [30]
          Cleaved-Caspase-3                     17/19 kDa   异常增殖 。本研究结果表明，马钱苷能够通过抑制
                                                            Cyclin D1、PCNA 基因蛋白的表达水平将细胞阻滞于 S
              Caspase-9                         37 kDa      期，从而抑制HepG2细胞增殖。
                                                                肿瘤的发生、发展是一个复杂过程，在肿瘤形成过
          Cleaved-Caspase-9                     37 kDa
                                                            程中激活抗凋亡信号通路和/或抑制促凋亡信号能够促
                                                                                        [31]
                                                            进细胞恶性转化，加速肿瘤形成 。目前研究得较为深
                β-actin                         43 kDa
                                                            入的与肿瘤发生发展密切相关的凋亡相关基因主要有
                      对照组   马钱苷低  马钱苷中   马钱苷高
                             浓度组   浓度组    浓度组               Bcl-2家族、Caspases家族等，其中Bcl-2是重要的抗凋亡
              图5   各组细胞中凋亡相关蛋白表达电泳图                         因子，能够增强细胞抵抗力，是肿瘤发生发展过程中重
        Fig 5  Electrophoretogram of expression of prolifera-
                                                            要的抗凋亡基因；而Caspases家族则是重要的诱导凋亡
               tion-related proteins in cells of each group
                                                            因子，其中Caspase-9是诱发凋亡的主要基因，Caspase-3
                                                                                           [32]
        表 4   各组细胞中凋亡相关蛋白的相对表达量（x±±s，                       是参与介导细胞凋亡的重要基因 。Caspase-3、Cas-
              n＝3）                                          pase-9 能够降解 DNA 修复酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶
        Tab 4 Relative expression of proliferation-related pro-  （PARP），从而直接参与细胞凋亡         [33-34] 。Cleaved-Cas-
               teins in cells of each group（x±±s，n＝3）       pase-3、Cleaved-Caspase-9 是 Caspase-3、Caspase-9 活化
                                                            后的剪切形式，在细胞凋亡过程中 Caspase-3、Caspase-9
                        Caspase-3/  Cleaved-Caspase-3/ Caspase-9/  Cleaved-Caspase-9/
        组别       Bcl-2/β-actin
                         β-actin  β-actin  β-actin  β-actin  活化为其剪切形式进而发挥诱发细胞凋亡的作用。有
        对照组      0.23±0.02  0.40±0.03  0.12±0.02  0.30±0.03  0.16±0.05  研究指出，激活 Caspases、抑制 Bcl-2 的表达能够促进肿
        马钱苷低浓度组 0.21±0.02  0.32±0.02 ＊  0.21±0.02 ＊  0.28±0.05  0.18±0.04                [35]
        马钱苷中浓度组 0.15±0.01 ＊＊  0.27±0.04 ＊  0.24±0.04 ＊  0.21±0.03 ＊  0.27±0.02 ＊  瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用 。因此，调节肿瘤细
        马钱苷高浓度组 0.08±0.02 ＊＊  0.08±0.03 ＊＊  0.31±0.04 ＊＊  0.12±0.03 ＊＊  0.38±0.04 ＊＊  胞凋亡相关蛋白的表达可作为诱导肿瘤细胞凋亡的一
                               ＊＊
            注：与对照组比较，P＜0.05， P＜0.01                         种策略。本研究结果表明，不同浓度的马钱苷能够抑制
                        ＊
                                   ＊＊
            Note：vs. control group，P＜0.05， P＜0.01           Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 等 蛋 白 的 表 达 ，促 进
                            ＊
        4 讨论                                                Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 蛋白的表达，提示
            肝癌恶性程度高，但早期症状轻微，不易察觉，故临                         马钱苷诱导肝癌 HepG2 细胞凋亡的作用可能与抑制
        床上肝癌早期诊断率较低，即使在发达国家，肝癌早期                            Bcl-2 蛋 白 的 表 达 ，促 进 Caspase-3、Caspase-9 活 化 有
        诊断患者也仅占30％左右，大部分肝癌患者在确诊时已                           关。山茱萸在我国多地均有分布，自然资源丰富，山茱
        进入晚期，这造成肝癌临床治疗难度大，严重影响患者                            萸既可食用又是中医临床上应用广泛的药物，具有巨大
        生存质量     [23-24] 。虽然随着科学技术的进步，近年来我国                 药用价值和功能食品开发潜能。马钱苷作为山茱萸中
        肝癌发生率有所降低，但肝癌依然严重威胁人类生命健                            的主要活性成分，本研究为山茱萸抗肿瘤物质基础研究
        康。肿瘤细胞异常增殖和抗凋亡在肿瘤发生发展过程                             和应用开发提供了理论依据。接下来，本课题组将在动
        中发挥着重要作用，因此针对肿瘤细胞的异常增殖和凋                            物实验中进一步研究马钱苷抑制肝癌的作用并探讨其
        亡失衡对其进行干预性调节成为了干预肿瘤发生发展                             作用机制，为马钱苷及山茱萸防治肝癌提供更多的理论
        的重要治疗策略。                                            依据。
            有研究表明，马钱苷在体外对人恶性黑色素瘤、乳                          参考文献
        腺癌、结肠癌细胞的恶性增殖均具有一定抑制作用                    [18-19，25] ，  [ 1 ]  SUN X，LI L，MA H，et al. Bisindolylmaleimide alkaloid
        但是关于马钱苷抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡的相关                                  BMA-155Cl induces autophagy and apoptosis in human


        ·786  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7                                   中国药房    2020年第31卷第7期
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