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种至6孔板中，将细胞随机分为对照组和马钱苷低、中、 2.7 统计学方法
高浓度组，每组设3个复孔。细胞培养至单层细胞密度 采用 GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析。计量
约 90％左右时，弃去培养基，马钱苷低、中、高浓度组 资料均以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，
细胞分别加入马钱苷终质量浓度分别为 50、100、150 两两比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
µg/mL的含药培养基5 mL，对照组细胞加入等体积培养 3 结果
基，培养 24 h。收集细胞，经 Hoechst 33342 荧光染料避 3.1 马钱苷对细胞增殖的影响
光染色10 min后，用PBS清洗5 min×3次，使用荧光显微 与对照组比较，不同浓度马钱苷作用24、48 h后，细
镜观察各组细胞的形态变化。采用流式细胞术检测细 胞的存活率均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈浓度
胞凋亡率。另取 HepG2 细胞同上述方法分组、给药、培 依赖趋势。当马钱苷质量浓度为50 µg/mL、作用24 h时
养24 h后，收集细胞，用细胞凋亡检测试剂盒中的Bind- 的细胞存活率为（73.10±2.23）％，提示该条件下马钱苷
ing buffer 500 μL 重悬，并加入 Annexin Ⅴ-FITC 和 PI 染 具有明显的细胞毒性，故以 50 µg/mL 作为后续试验中
液各5 μL，轻轻混匀，室温下避光孵育10～15 min，采用 马钱苷给药的最低浓度，依次选择 100、150 µg/mL 作为
流式细胞仪检测细胞凋亡率：细胞凋亡率＝早期凋亡 马钱苷给药的中浓度和高浓度，并选择 24 h 为作用时
率+晚期凋亡率。上述试验重复3次。 间。不同浓度马钱苷对 HepG2 细胞增殖的影响详见
2.5 马钱苷对细胞周期分布的影响考察 表1。
采用流式细胞术检测细胞周期分布。取对数生长 表1 不同浓度马钱苷对细胞增殖的影响（x±±s，n＝3）
期的 HepG2 细胞，按照“2.4”项下方法分组、给药，每组 Tab 1 Effects of loganin at different concentrations
设3个复孔。培养24 h后，收集细胞，加入细胞周期试剂
on cell proliferation（x±±s，n＝3）
盒中的PI染液500 μL重悬，并避光孵育30 min后，使用 细胞存活率，％
流式细胞仪检测细胞周期分布。上述试验重复3次。 组别 培养24 h 培养48 h
2.6 马钱苷对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 对照组 99.02±2.95 99.62±3.33
马钱苷10 μg/mL组 92.42±2.12 ＊ 85.42±4.27 ＊＊
考察
马钱苷25 μg/mL组 80.76±3.77 ＊＊ 79.76±2.75 ＊＊
采用 Western blotting 法检测蛋白表达。取对数生 马钱苷50 μg/mL组 73.10±2.23 ＊＊ 68.10±4.07 ＊＊
长期的 HepG2 细胞，按 2×10 个/皿接种至细胞培养皿 马钱苷100 μg/mL组 64.06±3.40 ＊＊ 60.06±3.95 ＊＊
6
马钱苷150 μg/mL组 50.62±2.47 ＊＊ 45.62±2.49 ＊＊
中，按“2.4”项下方法分组。细胞培养至单层细胞密度约
马钱苷200 μg/mL组 38.48±2.15 ＊＊ 35.48±2.31 ＊＊
90％时，弃去培养基，马钱苷低、中、高浓度组细胞加入 马钱苷300 μg/mL组 23.62±3.21 ＊＊ 22.62±2.70 ＊＊
含马钱苷终质量浓度分别为 50、100、150 µg/mL 的含药 马钱苷400 μg/mL组 17.64±2.64 ＊＊ 8.64±2.43 ＊＊
＊＊
＊
培养基10 mL，对照组细胞加入等体积培养基。培养24 注：与对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
h后，收集细胞，用M-PERTM哺乳动物蛋白抽提试剂提 Note：vs. control group，P＜0.05， P＜0.01
取细胞蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。将提取的细胞 3.2 马钱苷对细胞凋亡的影响
蛋白置于干式恒温器中于 95 ℃变性 5 min 后即得蛋白 Hoechst 33342染色结果显示，对照组细胞呈圆形或
样品。取蛋白样品 40 µg 经过 SDS-PAGE 分离后，转至 椭圆形，细胞核完整，边缘清晰，未见亮蓝色细胞核（核
聚偏氟乙烯（PVDF）膜（0.45 µm）上，以 5％脱脂牛奶封 固缩）。经不同浓度马钱苷作用 24 h 后，各组细胞中细
闭1 h后，分别加入兔Cyclin D1单克隆抗体、小鼠PCNA 胞数均减少，且均出现不同程度的核固缩、碎裂等凋亡
单克隆抗体、小鼠 Bcl-2 单克隆抗体、兔 Caspase-3 单克 现象，其中高浓度组细胞此现象最显著。各组细胞凋亡
隆抗体、兔 Cleaved-Caspase-3 单克隆抗体、兔 Caspase-9 形态学的显微镜图详见图 1（图中箭头所指为凋亡细
单克隆抗体、兔Cleaved-Caspase-9单克隆抗体、兔β-actin 胞）。
单克隆抗体（稀释度均为1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育过夜； 与对照组比较，马钱苷低、中、高浓度组细胞的凋亡
TBST清洗10 min×3次，再分别加入相应二抗（HRP标记 率均显著升高，且呈浓度依赖趋势（P＜0.01）。各组细
羊抗兔IgG二抗对应Cyclin D1、Caspase-3、Cleaved-Cas- 胞凋亡的散点图详见图2，凋亡率详见表2。
pase-3、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、β-actin 蛋白，HRP 3.3 马钱苷对细胞周期分布的影响
标记羊抗小鼠 IgG 二抗对应 PCNA、Bcl-2 蛋白，稀释度 经不同浓度马钱苷作用24 h后，马钱苷低、中、高浓
均为 1 ∶ 10 000），室温孵育 1 h；用 TBST 清洗 10 min×3 度组的S期细胞百分比均较对照组显著升高，G2/M期细
次，经ECL试剂显色后采用成像分析系统成像，使用Im- 胞百分比均较对照组显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；而
age J 1.8.0图像软件处理，以目标蛋白与内参（β-actin）条 G0/G1期细胞百分比与对照组比较差异均无统计学意义
带的灰度值比值作为目标条带的相对表达量。上述试 （P＞0.05）。各组细胞周期分布的流式细胞图详见图3，
验重复3次。 细胞周期分布百分比详见表2。

·784 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7 中国药房 2020年第31卷第7期