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2018 年世界癌症新增病例中，肝癌患者的占比高达                          抗体、兔 Caspase-3 单克隆抗体、兔活化的胱天蛋白酶 3
                                       [5]
            [4]
        8.2％ ；我国肝癌发病率居世界首位 ，每年新增肝癌患                        （Cleaved-Caspase-3）单克隆抗体、兔Caspase-9单克隆抗
                                               [6]
        者人数占全球新增肝癌患者人数的 50％以上 ，现已成                         体 、兔 Cleaved-Caspase-9 单 克 隆 抗 体 、兔 β 肌 动 蛋 白
        为严重威胁国民生命健康的重大问题。肝癌具有恶性                            （β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗
                                   [7]
        程度高、易转移、易复发等特点 ，临床治疗难度大。目                          兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗
        前，临床上肝癌主要以药物治疗为主，但是索拉菲尼等                           （美国 CST 公司，批号：2978、2586、15071、9665、9664、
        肝癌一线治疗药物长期使用易使患者产生耐受和多种                            9508、7237、4970、7074、7076）；Hoechst 33342 荧光染料
                                              [8-9]
        不良反应（如高血压、肝功能异常、肾毒性等） ，严重影                         （北京索莱宝科技有限公司，批号：B8040）；磷脂酰丝氨
        响药物的疗效及患者的预后。因此，探寻有效防治肝癌                           酸蛋白抗体-荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细
        的药物是一个亟待解决的问题。                                     胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒（江苏凯基生物技
            山茱萸为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis               术股份有限公司，批号：KGA107、KGA512）；BCA 蛋白
        Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果实，是被湖北省非物质文化                  定量试剂盒、ECL超敏化学发光液、M-PERTM哺乳动物
        遗产“武当山道教医药”代表性传承人陈吉炎教授建议                           蛋白抽提试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：
                               [10]
        优先发展的道地药材之一 。该药材主要含有环烯醚                            23227、34580、78501）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺
        萜苷、鞣质、有机酸等化学成分             [11-12] 。其中，马钱苷（Lo-     （SDS-PAGE）凝胶试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司，
                                               [13]
        ganin）是山茱萸中主要的环烯醚萜苷类成分 ，同时也                        批号：18D250）；DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS，pH
        是山茱萸质量控制指标之一，其具有抗氧化、抗炎、调节                          7.2～7.4）、胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自美国 Hy-
        免疫等多种药理学作用          [14-15] 。现代药理学研究表明，山           clone公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水
        茱萸具有降血糖、调节免疫、抗炎、抗氧化等作用，对肝                          为超纯水。
        癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤也具有抑制作用                   [16-17] 。马  1.3  细胞
        钱苷作为山茱萸中主要的活性成分，对结肠癌细胞、人                               HepG2 细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生
        恶性黑色素瘤细胞均具有抑制作用                [18-19] ，提示该化合物     物学研究所。
        具有开发成抗肿瘤药物的潜力。已有研究表明，山茱萸                           2 方法
        提取物能够抑制 B 淋巴细胞瘤 2（Bcl-2）的表达，同时活                    2.1  细胞培养
        化胱天蛋白酶3（Caspase-3）从而诱导人肝癌细胞HepG2                       取HepG2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基
        细胞凋亡    [20-21] 。为了进一步证明马钱苷是否同样也具有                 （以下简称“培养基”），于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养
        诱导肝癌细胞凋亡的作用，本研究以肝癌细胞HepG2为                         （以下细胞培养条件相同）。
        模型，考察不同浓度马钱苷对HepG2细胞增殖及凋亡的                         2.2  马钱苷对照品母液配制
        影响，并初步探讨其可能的作用机制，以期为马钱苷防                               精密称取马钱苷对照品 20.0 mg，溶于 1 mL 培养基
        治肝癌提供理论研究基础。                                       中，配成质量浓度为2×10 μg/mL的马钱苷对照品母液，
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        1 材料                                               经0.22 µm微孔滤膜滤过，置于－20 ℃保存，备用。
        1.1  仪器                                            2.3  马钱苷的细胞毒性考察
            MCO-15AC 型 CO2细胞培养箱（日本 Sanyo 公司）；                  采用CCK-8法检测。取对数生长期HepG2细胞，按
                       TM
        Trans-Blot Turbo 型全能型蛋白转膜仪、Power Pac Ba-           5 000 个/孔接种于 96 孔板中，将细胞随机分为对照组
                ®
        sic 型电泳仪、xMark 型酶标仪、TC20 型细胞计数仪（美                  和马钱苷不同浓度组，每组设 6 个复孔。马钱苷各浓
        国 Bio-Rad 公司）；Allegra 64R 型高速冷冻离心机（美国              度组细胞分别加入马钱苷终质量浓度分别为 10、25、
        Beckman 公司）；NoVoCyte D2060R 型流式细胞仪（艾森              50、100、150、200、300、400 µg/mL（浓度设置参考胡小
                                                                [22]
        生物科技有限公司）；CKX31 型倒置荧光显微镜（日本                        红等 研究方法）的含药培养基 100 μL，对照组细胞加
        Olympus 公司）；XB 220A 型分析天平（瑞士 Sartorius 公           入等体积培养基，另设不含细胞只含培养基的空白
        司）；G：BOX 型成像分析系统（英国 Syngene 公司）；                   组。分别于培养 24、48 h 时，各孔加入 CCK-8 试剂 10
        MK-10型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）。                           μL，继续培养 2 h，随后使用酶标仪于 450 nm 波长处测
        1.2 药品与试剂                                          定各孔的吸光度（A），计算细胞存活率：细胞存活率
            马钱苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公                          （％）＝（A 给药组－A 空白组）/（A 对照组－A 空白组）×100％。上述
        司，批号：4917，纯度：＞98％）；胎牛血清（美国 Gibco 公                 试验重复 3 次。
        司）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司，批号：CK04）；兔                 2.4 马钱苷对细胞凋亡的影响考察
        G1/S-特异性周期蛋白 D1（Cyclin D1）单克隆抗体、小鼠                     采用 Hoechst 33342 荧光染色法检测细胞凋亡形态
                                                                                                   6
        增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、小鼠Bcl-2单克隆                      变化。取对数生长期的 HepG2 细胞，按 1×10 个/孔接

        中国药房    2020年第31卷第7期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7  ·783  ·
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