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浓度的单细胞悬液并计数后用于后续试验。试验前以                             瘤情况的影响考察
        台盼蓝染色法测定，细胞存活率均在95％上。                                   将18只裸鼠随机分为对照组、顺铂单用组和芹菜素
        2.2 芹菜素对A549/DDP细胞增殖的影响考察                           联用组，每组6只。将含有A549/DDP细胞（1×10 个）的
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            取“2.1”项下对数生长期A549/DDP细胞，调整细胞                    PBS溶液200 μL皮下注射至裸鼠腋下区域，1～2周后可
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        浓度为5×10 个/mL，按每孔100 μL加至96孔板中，随机                    见肿瘤组织块生长。每2天用卡尺测量移植瘤长径（A，
        分为对照组、顺铂组和芹菜素低、高剂量组。对照组仅                            mm）和短径（B，mm），计算移植瘤体积（V，mm）：V＝A×
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        加入A549/DDP细胞；顺铂组加入顺铂（终质量浓度为5                        B ×π/6。当移植瘤生长至20～25 mm 时，对照组裸鼠注
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        μg/mL，剂量参考临床用药量对应的血药浓度设置）+                          射等量生理盐水，顺铂单用组裸鼠腹腔注射顺铂药液（2
        A549/DDP细胞；芹菜素低、高剂量组同法加入不同剂量                        mg/kg，隔天给药1次，剂量参照文献[7]设置），芹菜素联
        芹菜素（终浓度为 10、20 μmol/L，剂量参考文献[6]设                    用组裸鼠在顺铂给药的基础上腹腔注射芹菜素药液（30
        置）+A549/DDP 细胞。顺铂原料药以无菌生理盐水制                        mg/kg，每天给药1次，剂量参照前期实验结果设置），均
        成 10 g/L 的母液，芹菜素原料药以 DMSO 溶液制成 10                   连续给药18 d。顺铂、芹菜素药液均以生理盐水制成所
        mmol/L的母液，试验时均以RPMI 1640培养基稀释至相                     需浓度，无菌滤器过滤，当天使用。给药期间每天测量
        应浓度。                                                并计算移植瘤体积，记录裸鼠的体质量变化。给药结束
            采用 MTT 法检测细胞的增殖能力。各组细胞在                         后，处死裸鼠并剥离移植瘤组织块，称定瘤组织质量并
        37 ℃、5％CO2条件下分别培养24、48、72 h后，每孔加入                   计算抑瘤率：抑瘤率＝（对照组移植瘤组织质量－给药
        MTT试剂20 μL继续培养4 h。使用酶标仪在495 nm波                     组移植瘤组织质量）/对照组移植瘤组织质量×100％。
        长处测定各孔细胞光密度（OD）值，OD值越大则表示细                          2.6  不同细胞中 RAD51 mRNA 表达及芹菜素对其影
        胞增长数越多。试验均重复3次。                                     响考察
        2.3  芹菜素对A549/DDP细胞凋亡的影响考察                              取“2.1”项下对数生长期细胞，按“2.2”项下方法以
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            采用 Annexin Ⅴ/PI 双染色法结合流式细胞术检测                   1×10 个/孔加入96孔板，随机分为正常组、对照组、顺铂
        细胞凋亡情况。取对数生长期A549/DDP细胞，按“2.2”                      组和芹菜素低、高剂量组。正常组加入A549细胞（以含
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        项下方法按每孔1×10 个加至96孔板中，随机分为对照                         0.1％DMSO 的 RPMI 1640 培养基稀释，下同）；对照组、
        组、顺铂组和芹菜素低、高剂量组，并同法给药。各组细                           顺铂组和芹菜素低、高剂量组加入 A549/DDP 细胞和相
        胞在37 ℃、5％CO2条件下培养48 h后，以RPMI 1640培                  应药物。各组细胞在37 ℃、5％CO2条件下培养24 h后，
        养基制成 1×10 个/mL 的单细胞悬液，以 800 r/min 离心                采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，再采用逆转录试剂
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        5 min，PBS 洗涤，加入 Annexin Ⅴ-FITC 试液 5 μL、PI 试         盒对其进行逆转录获得cDNA（逆转录反应条件：42 ℃，
        液10 μL混匀后染色30 min。采用流式细胞仪检测细胞                       反应 30 min；逆转录酶失活条件：85 ℃，反应 15 s）。按
        凋亡数并计算凋亡率：细胞凋亡率＝凋亡细胞数/（凋亡                           照实时 PCR 试剂盒说明书要求操作，进行逆转录定量
        细胞数+正常细胞数）×100％。试验均重复3次。                            PCR检测（引物序列见表1）。PCR扩增反应条件：95 ℃
        2.4  芹菜素联用对 A549/DDP 细胞顺铂敏感性的影响                     预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，40个循环；
        考察                                                  75 ℃延伸10 min。取PCR产物5 μL，加载样缓冲液1 μL，
            依据“2.2”项下芹菜素对 A549/DDP 细胞增殖的影                   在 20 g/L 琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色后，采用凝
        响考察结果，采用MTT法考察芹菜素联用对A549/DDP                        胶成像仪分析。以GAPDH为内参，采用Image J 1.48软
        细胞顺铂敏感性的影响。取对数生长期 A549/DDP 细                        件分析目标基因的蛋白表达产物的相对灰度值，用来表
        胞，按“2.2”项下方法接种至96孔板中，分别加入不同质                        示其mRNA的相对表达量。试验均重复3次。
        量浓度的顺铂（1、2、4、8、16 μg/mL，剂量参照文献[6]设                                 表1 PCR引物序列
        置）作为顺铂单用组；另设芹菜素联用组，即在加入上述                                      Tab 1 PCR primer sequence
        质量浓度顺铂的基础上同时加入芹菜素（10 μmol/L）。                       基因名称                         序列
        各组细胞在 37 ℃、5％CO2条件下培养 24 h 后，加 MTT                  RAD51              5′-CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3′（正向）
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        试剂20 μL 继续培养4 h。采用酶标仪在495 nm波长处                     GAPDH              5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3′（正向）
        测定各孔细胞 OD 值并计算细胞增殖抑制率：增殖抑制                                             5′-TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3′（反向）
        率（％）＝（1－芹菜素联用组 OD 平均值/相应质量浓度                        2.7  不同细胞中RAD51蛋白的表达及芹菜素对其影响
        顺铂单用组 OD 平均值）×100％。采用回归分析模型计                        考察
        算药物的半数抑制浓度（IC50 ）。以 IC50值计算芹菜素的                         采用 Western blotting 法检测细胞中 RAD51 蛋白表
        逆转指数：逆转指数＝顺铂单用组IC50值/相应质量浓度                         达水平。按“2.6”项下方法将A549细胞和A549/DDP细
        芹菜素联用组IC50值。试验均重复3次。                                胞进行分组、给药，在 37 ℃、5％CO2条件下培养 24 h。
        2.5  芹菜素联用对顺铂作用后 A549/DDP 荷瘤裸鼠抑                     取细胞进行蛋白裂解，并采用 BCA 法检测蛋白质浓


        ·710  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6                                   中国药房    2020年第31卷第6期
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