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心 30 min，收集上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度。上 表 1 PD98059 联合紫杉醇对 KATO ⅢⅢ细胞增殖的影
清液经蛋白上样缓冲液稀释后，于 100 ℃下变性 5 响（x±±s）
min。取变性后的蛋白适量，进行 12％聚丙烯酰胺凝胶 Tab 1 Effects of PD98059 combined with paclitaxel
电泳，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以 5％脱 on the proliferation of KATO ⅢⅢ cells（x±±s）
脂奶粉于室温下封闭 1 h；分别加入 Cleaved-caspase-3、 组别 抑制率，％ 组别 抑制率，％
对照组 0 PD98059 40 μmol/L组 54.95±0.44 ＊
GAPDH 一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜，
紫杉醇1 μg/mL组 35.02±0.27 ＊ 紫杉醇1 μg/mL+PD98059 5 μmol/L组 39.09±0.57 ＊#Δ
用 TBST 溶液清洗 5 min×3 次；随后加入相应二抗（稀 PD98059 5 μmol/L组 21.54±1.10 ＊ 紫杉醇1 μg/mL+PD98059 20 μmol/L组 46.06±0.54 ＊#Δ
释 度 为 1 ∶ 1 000），室温孵育 1 h，用 TBST 溶液清洗 5 PD98059 20 μmol/L组 37.04±0.53 ＊ 紫杉醇1 μg/mL+PD98059 40 μmol/L组 62.71±0.35 ＊#Δ
＊
#
min×3 次，经 ECL 显色后，置于化学发光图像分析系统 注：与对照组比较，P＜0.05；与紫杉醇1 μg/mL组比较，P＜0.05；
Δ
上成像并采用Image J v1.8.0软件分析，以相应蛋白与内 与PD98059同剂量单用组比较，P＜0.05
＊
Note：vs. control group， P＜0.05；vs. paclitaxel 1 μg/mL group，
参GAPDH的灰度值比值表示该蛋白的表达量。
# P＜0.05；vs. the same dose of PD98059 alone group，P＜0.05
Δ
2.5 细胞迁移能力
采用 Transwell 法检测。取对数生长期的 KATO Ⅲ
10 6 10 6
细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至 1×10 6
个/mL，取上述细胞悬液 100 μL 置于 Transwell 小室上 10 5 10 5
PI PI
层，下层加入完全培养基 600 μL，培养 24 h。将细胞按
10 4 10 4
“2.3”项下方法分组，每组设 3 个复孔。弃去培养基，对
照组上、下层分别加入无血清的IMDM培养基100 μL和 10 3 10 3
完全培养基600 μL，各给药组上、下层分别加入含相应药 10 4 10 5 10 6 10 7 10 4 10 5 10 6 10 7
Annexin-Ⅴ-FITC-H Annexin-Ⅴ-FITC-H
物的无血清IMDM培养基100 μL和完全培养基600 μL， A. 对照组 B. 紫杉醇组
继续培养 48 h。弃去上、下层培养基，用棉签擦拭未穿
过小室底层的细胞，用PBS清洗2次，以4％多聚甲醛溶 10 6 10 6
液固定 20 min；用 PBS 清洗 3 次，以结晶紫染色 15 min，
10 5 10 5
用水清洗后，使用显微镜观察，每孔取5个视野，拍照并 PI PI
记录染色细胞数（染色后，发生迁移的细胞呈紫色），取 10 4 10 4
平均值作为检测结果。
10 3 10 3
2.6 统计学方法
10 4 10 5 10 6 10 7 10 4 10 5 10 6 10 7
采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资 Annexin-Ⅴ-FITC-H Annexin-Ⅴ-FITC-H
料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜ C. PD98059组 D. 紫杉醇+PD98059联用组
0.05为差异有统计学意义。 图 1 PD98059 联合紫杉醇对 KATO ⅢⅢ细胞凋亡影响
3 结果 的流式细胞图
3.1 PD98059联合紫杉醇对KATO ⅢⅢ细胞增殖的影响 Fig 1 Flow cytometries of PD98059 combined with
paclitaxel on the apoptosis of KATO ⅢⅢ cells
与对照组比较，各给药组细胞的增殖抑制率均显著
升高（P＜0.05），且该抑制率有随 PD98059 剂量增加而 表 2 PD98059 联合紫杉醇对 KATO ⅢⅢ细胞凋亡率、凋
升高的趋势；同时，两药联用组的抑制率均显著高于紫 亡蛋白表达以及迁移能力的影响（x±±s）
杉醇、PD98059 同剂量单用组（P＜0.05），详见表 1。由 Tab 2 Effects of PD98059 combined with paclitaxel
于 40 μmol/L PD98059 对细胞的抑制率接近 50％，且紫 on the apoptosis rate，the expression of apop-
杉醇与该剂量的 PD98059 联用作用更强，故选取 40 tosis related protein and the migration ability
μmol/L作为后续试验PD98059的剂量。 of KATO ⅢⅢ cells（x±±s）
3.2 PD98059联合紫杉醇对KATO ⅢⅢ细胞凋亡的影响 组别 凋亡率，％ 凋亡蛋白 迁移细胞，个
早期凋亡率 晚期凋亡率 Cleaved-caspase-3
与对照组比较，紫杉醇组和紫杉醇+PD98059 联用 对照组 5.74±2.52 4.88±0.58 0.43±0.03 132.33±10.97
组细胞的早期、晚期凋亡率均显著升高，且联用组显著 紫杉醇组 22.01±1.53 ＊ 23.96±2.00 ＊ 1.10±0.16 ＊ 107.33±10.69 ＊
高于紫杉醇、PD98059单用组（P＜0.05），详见图1、表2。 PD98059组 9.56±1.53 5.95±1.00 0.45±0.03 86.67±9.61 ＊
紫杉醇+PD98059联用组 25.93±1.00 ＊#Δ 31.43±1.15 ＊#Δ 1.49±0.10 ＊#Δ 68.33±6.67 ＊#Δ
3.3 PD98059联合紫杉醇对KATO ⅢⅢ细胞凋亡蛋白表
＊
#
注：与对照组比较，P＜0.05；与紫杉醇单用组比较，P＜0.05；与
达的影响
Δ
PD98059单用组比较，P＜0.05
与对照组比较，紫杉醇组和紫杉醇+PD98059 联用 Note：vs. control group， P＜0.05；vs. paclitaxel alone group，P＜
＊
#
组细胞 Cleaved-caspase-3 的表达量均显著升高，且联用 0.05；vs. PD98059 alone group，P＜0.05
Δ
中国药房 2020年第31卷第6期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6 ·705 ·