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胃癌总发病率的8％～30％           [1-3] ；同时有报道指出，与非印          2 方法
                                                [4]
        戒细胞癌相比，胃印戒细胞癌多发于年轻女性 。目前，                           2.1 细胞培养
        胃印戒细胞癌的临床治疗主要以手术及化疗为主，但胃                                将胃印戒细胞癌KATO Ⅲ细胞解冻、复苏并接种至
        印戒细胞癌患者对化疗药物不敏感，且肿瘤细胞一旦突                            含有 10％胎牛血清的 IMDM 培养基（以下简称“完全培
        破黏膜下层，则极易发生转移，导致患者预后不佳 。                            养基”）中，于5％CO2、37 ℃条件（下同）下培养，约3 d传
                                                      [5]
        PD98059 是一种丝裂原激活蛋白激酶激酶/细胞外信号                        代1次，取对数生长期的细胞进行后续试验。
        调节激酶（MEK/ERK）通路的特异性抑制剂，能有效阻                         2.2 细胞增殖情况
        止 MEK 对 ERK 的磷酸化，阻滞细胞内相关通路信号的                           采用 CCK-8 法检测。取对数生长期的 KATO Ⅲ细
        转导，从而影响肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等一系列生物                           胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至 5×10                      4
        反应 。紫杉醇作为一种天然植物来源的抗癌药物，广                            个/mL，按100 μL/孔接种至96孔板中，培养24 h，将细胞
             [6]
        泛应用于包括胃癌在内的多种肿瘤的临床治疗，其单药                            随机分为对照组，紫杉醇组（1 μg/mL），PD98059低、中、
        有效率达 20％～40％，但随着作用时间的延长，靶癌细                         高剂量组（5、20、40 μmol/L）以及紫杉醇+PD98059 联用
        胞产生的分子学抵抗限制了该药抗癌作用的发挥                        [7-8] 。  组（1 μg/mL 紫杉醇分别与 5、20、40 μmol/L PD98059 联
        有研究指出，PD98059与紫杉醇等其他抗肿瘤药物联用
                                                            用），各给药组剂量参考本课题组前期预试验结果设置，
        可增强后者的抗癌效果 ；且本课题组前期研究也有类
                             [9]
                                                            每组设3个复孔。对照组加入完全培养基100 μL，各给
        似发现。基于此，本研究拟通过分析PD98059联合紫杉
                                                            药组加入含相应药物的完全培养基 100 μL，继续培养
        醇对人胃印戒细胞癌细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨
                                                            48 h。弃去培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养1 h
        联合用药的抗癌效果，旨在为胃印戒细胞癌的治疗提供
                                                            后，使用酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔光密度（OD）
        新的靶点和思路。
                                                            值，并计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率＝[（对照组细
        1 材料                                                胞平均 OD 值－试验组细胞平均 OD 值）/对照组细胞平
        1.1  仪器
                                                            均OD值]×100％。上述试验重复3次（下同）。
            FORM 361 型细胞培养箱、MK2 型酶标仪（美国
                                                            2.3  细胞凋亡情况
        Thermo Fisher Scientific 公司）；Accuri C6 型流式细胞仪
                                                                采用流式细胞术检测。取对数生长期的 KATO Ⅲ
        （美国 BD 公司）；Mini-Protean 型蛋白电泳系统（美国
                                                            细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至 5×10                     6
        Bio-Rad 公司）；5200 型全自动化学发光图像分析系统
                                                            个/mL，按 100 μL/孔接种至 6 孔板中，培养 24 h，将细胞
        （上海天能科技有限公司）；Ti-E型显微镜（日本Nikon公
                                                            随机分为对照组、紫杉醇组（1 μg/mL）、PD98059 组（40
        司）；5702型常温离心机（德国Eppendrof公司）。
        1.2  药品与试剂                                          μmol/L）和 紫 杉 醇 +PD98059 联 用 组（1 μg/mL+40
                                                            μmol/L），各给药组剂量参考“2.2”项下结果设置，每组设
            紫杉醇对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号：
                                                            3个复孔。对照组加入完全培养基2 mL，各给药组加入
        IP0020，纯度：＞98％）；PD98059 对照品（美国 MCE 公
                                                            含相应药物的完全培养基2 mL，继续培养48 h。收集细
        司，批号：12764，纯度：99.33％）；IMDM 培养基、胎牛血
                                                            胞，以 800 r/min 离心 5 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲
        清 、胰 酶（美 国 Gibco 公 司 ，批 号 分 别 为 8228124、
                                                            液（PBS，pH 7.4）清洗3次。随后用PBS调整细胞密度至
        41G3332K、1730153）；Transwell测试盒（美国Corning公
                                                                6
                                                            1×10 个/mL，取上述细胞悬液 1 L，以 800 r/min 离心 5
        司，批号：27113030）；CCK-8试剂盒、含磷酸酶抑制剂的
                                                            min，弃去上清液，沉淀加入 Annexin Ⅴ -FITC 结合液
        RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液、
                                                            195 μL，轻轻重悬，然后依次加入Annexin Ⅴ-FITC 染色
        聚丙烯酰胺凝胶配胶试剂盒、结晶紫染色试剂（上海碧
        云天生物科技有限公司，批号分别为 C0038、P0013B、                      液 5 μL 和 PI 染色液 10 μL，轻轻混匀，于冰浴中染色 20
        P0010、P0015L、P0012AC、C0121）；膜联蛋白Ⅴ-硫氰酸               min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并使用 Ex-
        荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡检测试剂盒                  cel 2007软件计算各组细胞的早期、晚期凋亡率。
        （美国Invitrogen公司，批号：1753025）；山羊抗兔分裂型                 2.4 相关凋亡蛋白表达水平
        胱天蛋白酶 3（Cleaved-caspase-3）抗体、山羊抗兔甘油                     采用Western blotting法检测。取对数生长期的KA-
        醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化酶标记的                        TO Ⅲ细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至5×
                                                              6
        山羊抗兔IgG二抗（美国CST公司，批号分别为12/2017、                     10 个/mL，按 100 μL/孔接种至 6 孔板中，培养 24 h，按
        10/2017、06/2017）；ECL 发光试剂盒（美国 Millipore 公          “2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。对照组加入完全
        司，批号：1722003）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。                      培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基2
        1.3  细胞                                             mL，继续培养48 h。弃去培养基，用常温PBS清洗3次，
            人胃印戒细胞癌细胞株 KATO Ⅲ由中国科学院典                        每孔加入含磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液 100 μL，冰上
        型培养物保藏委员会细胞库提供。                                     裂解20 min，收集细胞裂解液，于4 ℃下以12 000 r/min离


        ·704  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6                                   中国药房    2020年第31卷第6期
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