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患者均知情同意并签署了知情同意书。                                  μL。反应条件：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，52 ℃退
        1.2 治疗方法                                           火 5 s，80 ℃延伸 5 s，5 个循环；前述环节重复共 40 个循
            根据是否联用五酯胶囊将患者分为单药组和联合                          环；最后72 ℃再延伸3 min。
        组。单药组用药方案：他克莫司胶囊（爱尔兰 Astellas                                        表1 引物序列
        Pharma Co. Limited，注册证号：国药准字 J20150101，规                         Tab 1 Primer sequence
        格：0.5 mg）初始剂量为 0.1～0.15 mg/kg，bid[根据血药             基因及位点              PCR引物序列            单碱基延伸引物
        浓度调整其剂量，调整依据为：1个月内FK506血药浓度                        CYP3A5基因 上游：5′-ACGTTGGATGAGACATGCTGCCCAATCAAC-3′ 5′-AATCAACTGACGA-
                                                           rs4646457  下游：5′-ACGTTGGATGATCTTCACCTCCCAATTGTC-3′ ATTGAC-3′
       （谷浓度，下同）控制在10～15 ng/mL，2～3个月时为9～
                                                           CYP3A5基因 上游：5′-ACGTTGGATGGGCACAGCTTTCTTGAAGAC-3′ 3′-GGAGAATGAGTTA-
        12 ng/mL，4～6 个月时为 7～10 ng/mL，6 个月后为 4～8            rs15524  下游：5′-ACGTTGGATGAGATGGAACCCTAAGTGGAG-3′ TTCTAAGGA-5′
        ng/mL]+吗替麦考酚酯胶囊（上海罗氏制药有限公司，批                       CYP3A5基因 上游：5′-ACGTTGGATGGTAATGTGGTCCAAACAGGG-3′ 3′-GAAAGAGCTCTTT-
                                                           rs776746  下游：5′-ACGTTGGATGATGTACCACCCAGCTTAACG-3′ TGTCTTTCA-5′
        准文号：国药准字H20031240，规格：0.25 g）0.5～0.75 g，
                                                           CYP3A4基因 上游：5′-ACGTTGGATGCTTCAAAAGATGCACAAGGG-3′ 3′-TGATCTCACTGCT-
        bid 或麦考酚钠肠溶片（德国 Novartis Pharma GmbH 公             rs4646437  下游：5′-ACGTTGGATGAGGGCAGGTCTATGCATAAG-3′ GTAG-5′
        司，注册证号：H20160051，规格：180 mg）360～540 mg，             CYP3A4基因 上游：5′-ACGTTGGATGTAAGGTTTCACCTCCTCCCT-3′ 3′-CCAATAAGGTGAG-
                                                           rs2242480
        bid+醋酸泼尼松片（山东新华制药有限公司，批准文号：                                下游：5′-ACGTTGGATGGCAGGAGGAAATTGATGCAG-3′ TGGATG-5′
                                                           CYP3A4基因 上游：5′-ACGTTGGATGCAGAAGGTGTTATCAGGTGC-3′ 3′-CTCCATCACACCC-
        国药准字 H37020647，规格：5 mg）10 mg，qd，口服行维               rs35599367  下游：5′-ACGTTGGATGCTCCTTGATCTCAGAGGTAG-3′ AG-5′
        持治疗。联合组患者在上述方案基础上加用五酯胶囊                            ABCB1基因  上游：5′-ACGTTGGATGAGCCACTGTTTCCAACCAGG-3′ 5′-TTGCACCTTCAGG-
       （四川禾正制药有限责任公司，批准文号：国药准字                             rs1128503  下游：5′-ACGTTGGATGGTTTTTTTCTCACTCGTCCTG-3′TTCAG-3′
        Z10983013，规格：每粒含五味子甲素 11.25 mg）2 粒，                ABCC2基因  上游：5′-ACGTTGGATGTTAACAACTACCAAGTGCGG-3′ 5′-CTCCGAGGGATC-
                                                           rs3740066  下游：5′-ACGTTGGATGTTCACTCCACCTACCTTCTC-3′ ACTTGTGACAT-3′
        bid，口服。
                                                           NR1I2基因  上游：5′-ACGTTGGATGTCACCTGAAGACAACTGTGG-3′ 5′-CCCCGTTGGCAA-
        1.3  FK506血药浓度测定                                   rs3814055  下游：5′-ACGTTGGATGGAGACCACGATTGAGCAAAC-3′ TCCCAGGTT-3′
            所有患者单用他克莫司或联用五酯胶囊至少 7 d                   [22]  POR基因  上游：5′-ACGTTGGATGTGTGGAGTACGAGACCAAGG-3′ 3′-CCCGCCGTTCTC-
                                                           rs1057868  下游：5′-ACGTTGGATGGACTTGCGCACGAACATGG-3′ CCCG-5′
        后，于服药前空腹抽取静脉血 5 mL，经乙二胺四乙酸
                                                           PPARA基因  上游：5′-ACGTTGGATGAACAATTGCGGAAGAACTGG-3′ 5′-AGGAAGCAAACAA-
       （EDTA）抗凝后分离血浆，于采血当日采用酶放大免疫                          rs4253728  下游：5′-ACGTTGGATGCATACCGCCCATACCTCAC-3′ AACGA-3′
        分析技术以Viva-E EMIT 型血药浓度分析仪（德国Sie-                   IL-3基因  上游：5′-ACGTTGGATGCTTTCCTTACTGCTCTCCTC-3′ 3′-AGGTGGAAGACTT-
                             ®
                                                           rs181781
        mens公司）检测各组患者FK506的血药谷浓度。计算经                               下游：5′-ACGTTGGATGGGTAAAGGGATGAGTGTGAC-3′ CTTCAAGATGA-5′
                                                           IL-10基因  上游：5′-ACGTTGGATGATTCCATGGAGGCTGGATAG-3′ 5′-ACCTATCCCTACT-
        日剂量校正后的血药浓度值，即血药谷浓度/日剂量（C/                         rs1800896  下游：5′-ACGTTGGATGGACAACACTACTAAGGCTTC-3′ TCCCC-3′
        D）[（ng/mL）/（mg/d）]值。对于超出检测线性范围的检                   CTLA4基因  上游：5′-ACGTTGGATGCTGTGTGTTCCTCTTGAGGG-3′ 3′-GGAGGGGCAACA-
        测极值予以剔除。                                           rs4553808  下游：5′-ACGTTGGATGACAACCTAATGGGCACTTCC-3′ GAGGTTTTT-5′
        1.4  患者基因型检测                                       CYP2C19基因 上游：5′-ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC-3′ 3′-AGTAATTTGTTAT-
                                                           rs4244285  下游：5′-ACGTTGGATGTCCATCGATTCTTGGTGTTC-3′ GGGTTCC-5′
        1.4.1 DNA 提取     采用 DNA 提取试剂盒（上海捷瑞生
                                                           CYP2C19基因 上游：5′-ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC-3′ 3′-TGGCCTTACCTG-
        物工程有限公司）提取患者血样中的DNA。                               rs4986893  下游：5′-ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3′ GAT-5′
        1.4.2  引 物 合 成 与 扩 增     采 用 Agena Assay Design    1.4.3  测序    碱基延伸反应完成后，各基因分型产物采
        Suite V2.0 在线软件（https：//agenacx.com/online-tools/）  用 MassARRAY 系统[美国 Sequenom 公司，该系统基于
        设计聚合酶链反应（PCR）引物和单碱基延伸引物，序列                         基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 技 术（MAL-
        见表 1。以 9700 GeneAmp 型 PCR 扩增仪（美国 Applied           DI-TOF- MS）]检测，结果使用 MassARRAY Typer 4.0 软
        Biosystems公司）进行扩增，反应体系（共5 μL）：DNA模                 件进行分析。该试验由上海邃志生物科技股份有限公
        板 1 μL，PCR 缓冲液（含 15 mmol/L MgCl2 ）0.625 μL，2.5     司完成。
        mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1 μL，25 mmol/L               1.5 统计学方法
        MgCl2 0.325 μL，PCR上、下游引物各0.5 μL，HotStar Taq            采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析。采用χ                2
        酶0.1 μL，无核酶水0.95 μL。反应条件：94 ℃预变性15                 检验分析各基因型分布是否符合 Hardy-Weinberg 平
        min；94 ℃变性 20 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共         衡。计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ 检验。
                                                                                                     2
        45 个循环；72 ℃再延伸 3 min。扩增后，将未反应的                     采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性分析，符合正
        dNTP去磷酸消化，反应体系（共2 µL）：无核酶水1.53 μL、                 态分布的数据以x±s表示，组间比较采用t检验；不符合
        虾碱性磷酸酶缓冲液 0.17 μL、1 U/µL 碱性磷酸酶 0.3                 正态分布的数据以 M（P25，P75）表示，组间比较采用
        µL。反应条件：于37 ℃下温育40 min，随后85 ℃加热5                   Kruskal-Wallis 检 验 或 Mann-Whitney U 检 验 。 采 用
        min，使酶失活。除去多余碱性磷酸酶后，对产物进行单                         Kruskal-Wallis 检验或 Spearman 秩相关检验分析各因素
        碱基延伸，反应体系（共 2 μL）：无核酶水 0.755 μL、10×                与他克莫司C/D值的相关性，将有统计学意义的因素作
        iPLEX 延伸反应缓冲液 0.2 μL、终止化合物 0.2 μL、                 为自变量、他克莫司C/D值作为因变量进行多元线性回
        iPLEX 延伸反应酶 0.041 μL、10 μmol/L 延伸引物 0.804          归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。


        中国药房    2020年第31卷第4期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 4  ·479  ·
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