Page 50 - 2020年2月第31卷第3期
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透明、封片,最后于显微镜下观察。各组大鼠脑组织病                            35%B;11~12.5 min,35%B→100%B;12.5~13 min,
        理学观察结果见图1。                                          100%B;13~13.1 min,100%B→5%B;13.1~15 min,
                                                            5% B);进 样 量 为 5 μ L;流 速 为 0.3 mL/min;柱 温 为
                                                            30 ℃。(2)质谱条件。采用ESI离子源,正离子模式下检
                                                            测,毛细管电压为 3 500 V,去溶剂气流量为 650 L/h,去
                                                            溶剂化温度350 ℃,离子源温度为110 ℃,MRM扫描测
                                                            定。L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的MRM条件见表2。
                                                                  表2 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的MRM条件
               A.空白组(大脑)                B.空白组(小脑)
                                                             Tab 2 MRM condition of L-Dopa,L-Tyr and L-Trp
                                                            成分    保留时间,min 母离子质荷比 子离子质荷比  锥孔电压,V  碰撞能,V  极性
                                                            L-Dopa  0.87   198.07  152.06  30      17    正
                                                            L-Tyr   1.13   182.18  136.20  28      16    正
                                                            L-Trp   1.74   205.09  118.06  30      25    正
                                                            2.5.2  血清样本处理       大鼠末次给药后,腹腔注射10%
                                                            水合氯醛进行麻醉,腹主动脉取血,3 000 r/min 离心 10
             C.胡桃醌高剂量组(大脑)           D.胡桃醌高剂量组(小脑)
                                                            min,取上清加入2倍活性炭,涡旋混合,4 ℃、13 000 r/min
                                                            离心10 min,取上清液,经0.45 mm微孔滤膜过滤后为空
                                                            白血清样本,-80 ℃低温保存备用;取各组大鼠血清样
                                                            本 200 μL,加入 800 μL 甲醇,涡旋 2 min,4 ℃ 13 000
                                                            r/min离心10 min,定量取800 μL的上清液氮气吹干,用
                                                            200 μL 初始流动相复溶,4 ℃ 13 000 r/min 离心 10 min,
             E.胡桃醌中剂量组(大脑)           F.胡桃醌中剂量组(小脑)          取上清液备用。
                                                            2.5.3  对照品溶液的制备            分别精密称取 L-Dopa、
                                                            L-Tyr、L-Trp 对照品适量,置于 10 mL 量瓶中,用甲醇制
                                                            成质量浓度为 1 mg/mL 的标准储备液,4 ℃低温保存待
                                                            用。精确量取 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 对照品储备液适量,
                                                            用 甲 醇 制 成 L-Dopa、L-Tyr 质 量 浓 度 分 别 为 64 000、
             G.胡桃醌低剂量组(大脑)           H.胡桃醌低剂量组(小脑)          16 000、4 000、1 000、250、62.5 ng/mL,L-Trp 质量浓度分
              图1 各组大鼠脑组织病理学显微图(×40)                         别为 32 000、8 000、2 000、500、125、31.25 ng/mL 的系列
        Fig 1  Pathology micrograph brain tissue of rats in  对照品溶液。
               each group(×40)                              2.5.4  专属性试验      分别取空白血清、空白血清+混合
                                                            对照品溶液(与 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 的对照品溶液适量
            由图 1 可知,空白组大鼠大脑组织皮层椎体细胞形
                                                            混合)、末次灌胃给药后大鼠的血清样品,按“2.5.2”项下
        态结构完整,胞核清晰,毛细血管未见明显充血;小脑组
                                                            方法处理样品后,再按“2.5.1”项下的色谱与质谱条件进
        织的蒲金野氏细胞层细胞形态清晰、结构完整、排列规
                                                            样分析,记录色谱图。结果表明,空白血清基质对所测
        则,毛细血管未见明显充血。胡桃醌各剂量组大鼠大脑
                                                            的3种成分不产生影响,各离子通道中的目标待测物未
        组织出现皮质内小血管充血,锥体细胞层部分神经元固
                                                            出现明显的干扰峰,末次灌胃给药后大鼠的血清样品中
        缩,核深染,形态不规整,边界不清晰,尤其胡桃醌高剂
                                                            各待测物出峰位置和空白血清加混合对照品的出峰位
        量组现象较为明显,神经元甚至溶解消失;小脑皮质内                            置一致,说明该方法专属性较好。样品总离子流图见
        小血管充血,部分蒲金野氏细胞的细胞质内可见微小空                            图2。
        泡、肿胀,胡桃醌高、中剂量组部分细胞核深染、变小,甚                          2.5.5  线性关系、检测限及定量限考察                取空白血清
        至溶解消失。                                              200 μL,加入 800 μL 甲醇,涡旋 2 min,4 ℃ 13 000 r/min
        2.5 大鼠血清中L-Dopa 、L-Tyr 、L-Trp的含量测定                  离心 10 min,定量取 800 μL 的上清液,精密加入“2.5.3”
        2.5.1  色谱与质谱条件 (1)色谱条件。色谱柱为 Wa-                     项下系列质量浓度的 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 对照品溶液
        ters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm,        100 μL,共同氮气吹干后,用 200 μL 初始流动相复溶,
        1.7 μm);流动相为 5 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)-乙腈                  最后制成 L-Dopa(31.25、125、500、2 000、8 000、32 000
        (B),梯度洗脱(0~2 min,5%B;2~11 min,5%B→                  ng/mL)、L-Tyr(31.25、125、500、2 000、8 000、32 000


        ·300  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 3                                   中国药房    2020年第31卷第3期
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