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透明、封片,最后于显微镜下观察。各组大鼠脑组织病 35%B;11~12.5 min,35%B→100%B;12.5~13 min,
理学观察结果见图1。 100%B;13~13.1 min,100%B→5%B;13.1~15 min,
5% B);进 样 量 为 5 μ L;流 速 为 0.3 mL/min;柱 温 为
30 ℃。(2)质谱条件。采用ESI离子源,正离子模式下检
测,毛细管电压为 3 500 V,去溶剂气流量为 650 L/h,去
溶剂化温度350 ℃,离子源温度为110 ℃,MRM扫描测
定。L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的MRM条件见表2。
表2 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp的MRM条件
A.空白组(大脑) B.空白组(小脑)
Tab 2 MRM condition of L-Dopa,L-Tyr and L-Trp
成分 保留时间,min 母离子质荷比 子离子质荷比 锥孔电压,V 碰撞能,V 极性
L-Dopa 0.87 198.07 152.06 30 17 正
L-Tyr 1.13 182.18 136.20 28 16 正
L-Trp 1.74 205.09 118.06 30 25 正
2.5.2 血清样本处理 大鼠末次给药后,腹腔注射10%
水合氯醛进行麻醉,腹主动脉取血,3 000 r/min 离心 10
C.胡桃醌高剂量组(大脑) D.胡桃醌高剂量组(小脑)
min,取上清加入2倍活性炭,涡旋混合,4 ℃、13 000 r/min
离心10 min,取上清液,经0.45 mm微孔滤膜过滤后为空
白血清样本,-80 ℃低温保存备用;取各组大鼠血清样
本 200 μL,加入 800 μL 甲醇,涡旋 2 min,4 ℃ 13 000
r/min离心10 min,定量取800 μL的上清液氮气吹干,用
200 μL 初始流动相复溶,4 ℃ 13 000 r/min 离心 10 min,
E.胡桃醌中剂量组(大脑) F.胡桃醌中剂量组(小脑) 取上清液备用。
2.5.3 对照品溶液的制备 分别精密称取 L-Dopa、
L-Tyr、L-Trp 对照品适量,置于 10 mL 量瓶中,用甲醇制
成质量浓度为 1 mg/mL 的标准储备液,4 ℃低温保存待
用。精确量取 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 对照品储备液适量,
用 甲 醇 制 成 L-Dopa、L-Tyr 质 量 浓 度 分 别 为 64 000、
G.胡桃醌低剂量组(大脑) H.胡桃醌低剂量组(小脑) 16 000、4 000、1 000、250、62.5 ng/mL,L-Trp 质量浓度分
图1 各组大鼠脑组织病理学显微图(×40) 别为 32 000、8 000、2 000、500、125、31.25 ng/mL 的系列
Fig 1 Pathology micrograph brain tissue of rats in 对照品溶液。
each group(×40) 2.5.4 专属性试验 分别取空白血清、空白血清+混合
对照品溶液(与 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 的对照品溶液适量
由图 1 可知,空白组大鼠大脑组织皮层椎体细胞形
混合)、末次灌胃给药后大鼠的血清样品,按“2.5.2”项下
态结构完整,胞核清晰,毛细血管未见明显充血;小脑组
方法处理样品后,再按“2.5.1”项下的色谱与质谱条件进
织的蒲金野氏细胞层细胞形态清晰、结构完整、排列规
样分析,记录色谱图。结果表明,空白血清基质对所测
则,毛细血管未见明显充血。胡桃醌各剂量组大鼠大脑
的3种成分不产生影响,各离子通道中的目标待测物未
组织出现皮质内小血管充血,锥体细胞层部分神经元固
出现明显的干扰峰,末次灌胃给药后大鼠的血清样品中
缩,核深染,形态不规整,边界不清晰,尤其胡桃醌高剂
各待测物出峰位置和空白血清加混合对照品的出峰位
量组现象较为明显,神经元甚至溶解消失;小脑皮质内 置一致,说明该方法专属性较好。样品总离子流图见
小血管充血,部分蒲金野氏细胞的细胞质内可见微小空 图2。
泡、肿胀,胡桃醌高、中剂量组部分细胞核深染、变小,甚 2.5.5 线性关系、检测限及定量限考察 取空白血清
至溶解消失。 200 μL,加入 800 μL 甲醇,涡旋 2 min,4 ℃ 13 000 r/min
2.5 大鼠血清中L-Dopa 、L-Tyr 、L-Trp的含量测定 离心 10 min,定量取 800 μL 的上清液,精密加入“2.5.3”
2.5.1 色谱与质谱条件 (1)色谱条件。色谱柱为 Wa- 项下系列质量浓度的 L-Dopa、L-Tyr、L-Trp 对照品溶液
ters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm, 100 μL,共同氮气吹干后,用 200 μL 初始流动相复溶,
1.7 μm);流动相为 5 mmol/L 乙酸铵水溶液(A)-乙腈 最后制成 L-Dopa(31.25、125、500、2 000、8 000、32 000
(B),梯度洗脱(0~2 min,5%B;2~11 min,5%B→ ng/mL)、L-Tyr(31.25、125、500、2 000、8 000、32 000
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