Page 104 - 2020年2月第31卷第3期

GRIN2B 基因相关的 12 个 SNP 位点，包括 rs11055514、 处碱基，进而进行 SNP 分型。参考文献[6]设置单碱基
rs11055515、 rs12814951、 rs74816802、 rs2160517、 延伸反应条件：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，52 ℃退
rs2193149、rs966664、rs1805476、rs1806201、rs1805522、 火5 s，80 ℃延伸5 s，40个循环，其中每个循环中52 ℃退
rs3764030、rs1019385。采用 Assay Designer 3.1 软件进 火和80 ℃延伸再进行5个循环；最后72 ℃延伸3 min。
行引物设计，包括上游引物、下游引物及延伸引物。 2.4 数据处理
GRIN2B基因12个位点的引物序列见表1。 采用 Sequenom MassArray 飞行时间质谱生物芯片
表1 GRIN2B基因12个SNP位点的引物序列 系统，以χ 检验将对照组和癫痫组受试者 GRIN2B 基因
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Tab 1 Primer sequence of 12 SNP loci of GRIN2B 12个SNP位点进行Hardy-Weinberg平衡检验，比较观察
gene 值与预测值的差异，P＞0.05 表示符合 Hardy-Weinberg
平衡。采用Haploview 4.2软件对12个SNP位点进行连
SNP位点 引物 引物序列（5′→3′） 片段长度，bp
rs11055514 上游引物 ACGTTGGATGCTTACCAAGATAGCTAAGGG 97 锁不平衡（LD）分析，即在某一群体中，不同座位上某两
下游引物 ACGTTGGATGGATCTCTCTTTCTATACCTTG 个等位基因出现在同一条单体型上的频率与预期的随
延伸引物 TCTCTTTCTATACCTTGATTGCTAA 机频率之间存在明显差异的现象。当 D’＞0.9 且 r ＞
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rs11055515 上游引物 ACGTTGGATGAAAAACCCCTTGCCCAGTTG 100
下游引物 ACGTTGGATGGAAACAGATCCCAACCCAAG 1/3，则视为存在LD现象。采用Pearson相关性分析进行
延伸引物 CCTCTCCAGTCCAAGACTCCT 单倍体分析，用假阳性发现率（FDR）法进行多位点数据
rs12814951 上游引物 ACGTTGGATGGGATGGAAAAGAGCTGCTTC 94 分析校正多重检验。采用 SPSS 21.0 和 Plink 1.07 软件
下游引物 ACGTTGGATGTAATTGGCCTAGGAGATGGG
延伸引物 AGGTGAGTTTTGTTCTTGGTCTTA 进行统计，组间基线数据中的连续变量符合正态分布，
rs74816802 上游引物 ACGTTGGATGATCTGGTAAACAGCTGGTGG 107 采用 t 检验，有序分类变量分析和两组间基因频率的比
下游引物 ACGTTGGATGGGTCCATTTATTGGCCCAAA 较采用χ 检验。采用基因型检验（GENO）、趋势χ 检验
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延伸引物 CCCCCCAAATGAGATTCATGAAC
rs2160517 上游引物 ACGTTGGATGGACTTGTCACTGCCTGTAAC 117 （TREND）、显 性 基 因 检 验（DOM）和 隐 性 基 因 检 验
下游引物 ACGTTGGATGATTATTCCCCTTTGGGAGGC （REC）分析两组受试者 GRIN2B 基因的 12 个 SNP 位点
延伸引物 CCCCTTGTGCTAATTTAAAGCATACT 野生纯合子（AA）、突变杂合子（Aa）及突变纯合子（aa）
rs2193149 上游引物 ACGTTGGATGCAACAGGACCACTGTATTTC 106 的基因型分布。校正年龄和性别后，构建携带 GRIN2B
下游引物 ACGTTGGATGAAAGACAAGGTGGTGACCAG
延伸引物 GGGATGCCACAAATGTGGAAGTAGC 等位基因与病例对照的 Logistic 回归模型，采用 t 检验，
rs966664 上游引物 ACGTTGGATGGTATGATTATACATGCAAG 119 检测项目包括基因的加性效应（ADD）和基因显性效应
下游引物 ACGTTGGATGGAAGCTGAATCTCTGCAATG （DOMDEV）。 L95、U95 代 表 预 测 值 95％ 置 信 区 间
延伸引物 CATCTCTTTGACTCCTACCCTGAA
rs1805476 上游引物 ACGTTGGATGAACTGCTACAGAGCAGACAG 114 （CI），当优势比（OR）＞1且L95＞1时，表示该等位基因
下游引物 ACGTTGGATGTCTTTTCGTACCTCCAGAGC 确实有致病作用；当OR＜1且U95＜1时，表示该等位基
延伸引物 TGCAGCTCATTTCTCTTAAA 因有保护作用；当 OR＝1 时，表示该位点与疾病无任何
rs1806201 上游引物 ACGTTGGATGGGATGTTGGAGTGTGTGTTG 119
下游引物 ACGTTGGATGAGGGTATCTACAGCTGCATC 关系。P＜0.05表示差异有统计学意义。
延伸引物 CCCGTAATGAACTCCCCCAC 3 结果
rs1805522 上游引物 ACGTTGGATGTTAAACACCAGACCCCAGAG 100 3.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果
下游引物 ACGTTGGATGCTTTTTGTCATGCCAGAGCC 本研究中 GRIN2B 基因的 12 个 SNP 位点基因型观
延伸引物 GACCCTCTTTCACCAT
rs3764030 上游引物 ACGTTGGATGGGAATGCATTTTTCTCACCC 115 察值与预测值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），各位
下游引物 ACGTTGGATGATGGTCATTCCCAAAGCGTC 点均符合Hardy-Weinberg平衡，表明该研究具有群体代
延伸引物 GGGCTTGATTCGCGTGT 表性。GRIN2B 基因 12 个 SNP 位点的 Hardy-Weinberg
rs1019385 上游引物 ACGTTGGATGTCACACTCAAAAACGTGCCG 118
下游引物 ACGTTGGATGCAGCTTCGTGGGTTTCTCCT 平衡情况见表2。
延伸引物 TGTGTGCGAGGTAGGG 3.2 LD和单倍体分析结果
2.3 基因分型 由 rs11055514、rs11055515、rs12814951、rs748168-
取“2.1”项下提取的 DNA，通过聚合酶链式反应 02、rs2160517、rs2193149、rs966664组成的区块1（Block1）
（PCR）扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用虾 和由 rs3764030、rs1019385 组成的 Block2 各位点之间存
碱性磷酸酶（SAP）去除 PCR 体系中剩余的脱氧核糖核 在明显 LD 现象，其 D’＞0.9 且 r ＞1/3。进一步比较发
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苷三磷酸（dNTP）和引物，再加入单碱基延伸引物，其 现，对照组与癫痫组比较 P＞0.05，提示 LD 与癫痫发病
3′末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全 不相关。GRIN2B基因12个SNP位点的LD分析结果见
互补，采用 4 种 ddNTP 替代 dNTP，这样，探针在 SNP 位 图1。
点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等 相邻 SNP 的等位位点倾向于以一个整体遗传给后
位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 代，位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位
检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点 点被称作单体型。本研究的两个区块共构建出9个单体

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