Page 29 - 2020年1月第31卷第2期

避光孵育2 h；加入DAPI避光染色5 min，用水溶性封片 验。P＜0.05为差异有统计学意义。
剂封孔，于荧光倒置显微镜下观察、拍照。随机选取6个 3 结果
视野，记录视野内细胞总数目（N1 ）和心肌细胞数（n1，即 3.1 原代心肌细胞的鉴定
荧光阳性细胞数），计算心肌细胞比例：心肌细胞比例＝ 显微镜下可见，原代心肌细胞呈星形或者梭形生
n1/N1×100％。当该比例超过85％，表明原代心肌细胞纯 长，相互接触交织成网，且呈现同步搏动，搏动频率、节
[6]
度达到试验要求，可用以进行后续研究 。 律、强度稳定，频率为70～130次/min。原代心肌鉴定结
2.3 分组、造模与给药
[6]
果见本课题组已发表文献 。
取“2.2”项下原代心肌细胞适量接种于 96 孔板中，
3.2 参附益心方对缺氧原代心肌细胞ATP含量的影响
将其随机分成正常组、模型组、辅酶Q10组（阳性对照，1×
与正常组比较，模型组细胞ATP含量显著降低（P＜
10 －4 mol/L，剂量参考本课题组前期 CCK-8 试验结果设
0.05）；与模型组比较，辅酶Q10组和参附益心方高剂量组
置）和参附益心方低、高剂量组（0.25、0.5 mg/mL，以浸膏
细胞ATP含量均显著升高（P＜0.05），详见表1。
干粉质量计，剂量参考本课题组前期CCK-8试验结果设
表1 参附益心方对缺氧原代心肌细胞ATP含量的影响
置），每组设3个复孔。正常组和模型组加入完全培养基
（x±±s，n＝3）
2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基 2 mL。
Tab 1 Effects of Shenfu yixin decoction on ATP con-
除正常组外，其余各组细胞均于 5％O2、5％CO2、90％N2
tent in primary hypoxic cardiomyocytes（x±±s，
条件下培养 6 h（缺氧时间根据本课题组前期 YOYO-1
n＝3）
染色试验结果确定），复制缺氧损伤模型；正常组细胞则
于37 ℃、5％CO2条件下培养6 h。 组别 ATP，μg/mL 组别 ATP，μg/mL
正常组 1.59±0.05 参附益心方低剂量组 1.05±0.10
2.4 缺氧原代心肌细胞中ATP含量检测 模型组 0.89±0.02 ＊ 参附益心方高剂量组 1.34±0.01 #
按“2.2”项下方法分离、培养、鉴定原代心肌细胞后， 辅酶Q10组 1.32±0.08 #
再按“2.3”项下方法分组、给药、造模。缺氧6 h后，吸弃 注：与正常组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
#
＊
＊
各孔上清液，用常温 PBS 清洗 2～3 次，每次 1 min，然后 Note：vs. normal group， P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
#
采用荧光素酶发光法以酶标仪检测细胞中ATP的含量， 3.3 参附益心方对缺氧原代心肌细胞中 FAT/CD36、
严格按照相应试剂盒说明书重复操作3次。 PPARα、PPARβ/δ蛋白表达的影响
2.5 缺氧原代心肌细胞中FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ 与正常组比较，模型组细胞中 FAT/CD36 蛋白的相
蛋白表达水平检测 对表达量显著降低（P＜0.05）；而 PPARα、PPARβ/δ蛋白
按“2.2”项下方法分离、培养、鉴定原代心肌细胞后， 的相对表达量与正常组比较差异均无统计学意义（P＞
再按“2.3”项下方法分组、给药、造模。缺氧6 h后，采用 0.05）。与模型组比较，辅酶 Q10 组细胞中 FAT/CD36、
Western blotting 法检测心肌细胞中 FAT/CD36、PPARα、 PPARα蛋白，参附益心方高剂量组细胞中 FAT/CD36 蛋
PPARβ/δ蛋白的表达情况。用 RIPA 蛋白裂解液 300 μL 白以及参附益心方各剂量组细胞中 PPARα、PPARβ/δ蛋
反复吹打破碎细胞，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min后， 白的相对表达量均显著降低（P＜0.05），详见图1、表2。
取上清液。采用 BCA 法测定各组细胞的蛋白浓度后，
GAPDH
加入 4×蛋白上样缓冲液适量，于 100 ℃煮沸变性 5
FAT/CD36
min。取变性后的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳（先于 80 V 正常组 模型组 辅酶Q10组 参附益心方 参附益心方
低剂量组 高剂量组
下电泳20 min，再于120 V下电泳1 h），湿法转膜（恒流： A. FAT/CD36
250 mA，时间：2 h），以 5％脱脂奶粉室温下封闭 2 h 后， GAPDH
PPARα
加入相应一抗（FAT/CD36、PPARα、PPARβ/δ、GAPDH，
正常组 模型组 辅酶Q10组 参附益心方 参附益心方
稀释度分别为1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 4 000），4 ℃ 低剂量组 高剂量组
B. PPARα
孵育过夜；然后加入相应二抗（稀释度为1 ∶ 5 000），室温
GAPDH
孵育 2 h 后，经 ECL 发光液孵育后于化学发光成像系统
PPARβ/δ
上显影并拍照。采用 Image Pro Plus 6.0 软件分析各蛋 正常组 模型组 辅酶Q10组 参附益心方 参附益心方
低剂量组 高剂量组
白条带的灰度值，以目的蛋白与内参 GAPDH 条带的灰 C. PPARβ/δ
度值比值来表示蛋白的相对表达量。上述试验重复 图 1 各组缺氧原代心肌细胞中 FAT/CD36、PPARα、
3次。 PPARβ/δ蛋白表达的电泳图
2.6 统计学方法 Fig 1 Electropherograms of the expression of FAT/
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资 CD36，PPARα and PPARβ/δ protein in prima-
料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析或 t 检 ry hypoxic cardiomyocytes of each group

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