Page 28 - 2020年1月第31卷第2期
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究证实，抑制脂肪酸利用可改善心肌能量代谢，延缓心                            11699695001）；兔抗大鼠脂肪酸转位酶（FAT/CD36）多
        衰病程进展     [2-3] 。                                   克隆抗体（批号：ab64014）、兔抗大鼠过氧化物酶体增殖
            参附益心方为治疗心衰的经验方。有不少研究证                           物激活受体α（PPARα）多克隆抗体（批号：ab24509）、兔
        明，该方可改善慢性心衰模型大鼠的心功能，降低其血                            抗大鼠PPARβ/δ多克隆抗体（批号：ab23673）均购自艾博
        清心房钠尿肽（ANP）、B 型脑钠肽（BNP）和心肌血管紧                       抗（上海）贸易有限公司；兔抗大鼠 GAPDH 多克隆抗体
        张素Ⅱ（AngⅡ）水平，下调心肌细胞及其线粒体中活性                         （批号：10494-1-AP）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔
        氧（ROS）的表达，并上调ATP、肌酸激酶（CK）的含量，提                      IgG二抗（批号：SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有
        高心肌细胞膜Na -K -ATP酶活性，从而达到缓解心衰症                       限公司；胎牛血清（FBS，以色列 Biological Industries 公
                          +
                       +
        状的目的     [4-6] 。但目前有关该方对脂肪酸利用的影响尚                   司，批号：04-001-1A）；其余试剂均为分析纯，水为双
        未明确。为此，本研究拟建立缺氧原代心肌细胞模型，                            蒸水。
        观察参附益心方对其脂肪酸利用的影响，并初步探讨可                            1.3 动物
        能的作用机制，以期为该方治疗慢性心衰提供更有力的                                SPF 级 SD 大鼠，新生 1～3 d，雌雄不限，体质量约
        理论依据。                                               5～6 g，由河南省动物实验中心提供，动物生产许可证
        1 材料                                                号：SCXK（豫）2015-0005。
        1.1 仪器                                              2 方法
            BCM-1000A 型生物超净工作台（苏净集团苏州安                      2.1 药液制备
                                                                                                         [6]
        泰空气技术有限公司）；RCO-3000TVBB 型 CO2培养箱                    2.1.1  参附益心方药液         参考本课题组已发表文献 ，
        （美国Revco公司）；JA203型电子分析天平（上海海康电                      称取参附益心方浸膏干粉0.25 g，用DMEM高糖培养基
        子仪器厂）；TDL-50B型低速台式大容量离心机（北京医                        10 mL 稀释，经 0.2 μm 滤膜滤过后，制得质量浓度为 25
        用离心机厂）；CK40 型倒置显微镜（日本 Olympus 公                     mg/mL（以浸膏干粉质量计）的药液。需现用现配。
        司）；DMI3006 型荧光倒置显微镜（德国 Leica 公司）；                   2.1.2  辅酶 Q10药液    称取辅酶 Q10片 50 mg，用 DMEM
        MK3 型酶标仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；           高糖培养基 5.8 mL 稀释，经 0.2 μm 滤膜滤过后，制得浓
        ChemiDoc XRS + 型 化 学 发 光 成 像 分 析 系 统（美 国            度为1×10 mol/L的药液，备用。
                                                                    －2
        Bio-Rad公司）。                                         2.2  原代心肌细胞分离、培养与鉴定
        1.2  药品与试剂                                              于无菌条件下取出乳鼠的心尖部，以4 ℃的PBS清
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            参附益心方浸膏干粉（山东步长制药股份有限公                           洗 3 次，随后将其剪成约 1 mm 大小的组织块，经含
        司，批号：131101，规格：1 g干粉相当于生药总量9.5 g）；                  0.08％胰蛋白酶的心肌细胞消化液吹打混匀后，转移至
        辅 酶 Q10 片 [ 卫 材（中 国）药 业 有 限 公 司 ，批 号 ：              玻璃瓶内，于37 ℃水浴中孵育6 min，自然沉淀，弃去上
        H10930021，规格：10 mg]；心肌细胞消化液（含胰蛋白酶                   清液；再同法反复消化约 7～8 次，直到组织块变成白色
        0.16 g、氯化钠 1.6 g、碳酸氢钠 0.070 6 g、葡萄糖 0.198 2         透亮状。取各次自然沉淀后的上清液与等体积含 20％
        g、氯化钾0.059 6 g、羟乙基哌嗪乙磺酸0.4 g、ddH2O 200              FBS 的 DMEM 高糖培养基混匀，以 1 000 r/min 离心 5
        mL，批号：T1320）、DMEM高糖培养基（批号：12100）、磷                  min，弃去上清液，沉淀与含 10％FBS 的 DMEM 高糖培
        酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：P1020）、RIPA 蛋白裂解                养基（以下简称“完全培养基”）1 mL混合，用200目筛网
        液（批号：R0010）、蛋白上样缓冲液（批号：P1015）、                      滤过，去除未完全消化的组织块，得细胞悬液。取上述
        CCK-8试剂（批号：CA1210）、BCA蛋白浓度测定试剂盒                     细胞悬液适量，于37 ℃、5％CO2培养箱（下同）中差速贴
        （批号：PC0020）、ECL 发光液（批号：PE0010）均购自北                  壁培养 90 min 后，吸取细胞悬液，以 1 000 r/min 离心 5
        京索莱宝科技有限公司；溴脱氧尿核苷（Brdu，批号：                          min，弃去上清液，沉淀与完全培养基充分混合，制成细
        B9285）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批号：D9542）               胞悬液。取少量该细胞悬液，用 0.4％台盼蓝染色液染
        均购自美国 Sigma 公司；YOYO-1 染料（批号：Y3601）、                 色，在倒置显微镜下计数以计算活细胞比率（染色后，死
        逆转录试剂盒（批号：11752050）、扩增试剂盒（批号：                       细胞呈蓝色）：活细胞比率＝活细胞数/（活细胞数+死细
        11744500）均购自美国 Invitrogen 公司；Opti-MEM 培养            胞数）×100％。用完全培养基将细胞浓度调整为 4×10                   5
        基（批号：31985088）、胰蛋白酶（批号：27250018）均购自                 个/mL，加入浓度为 0.1 mmol/L 的 Brdu 溶液中以抑制成
        美国Gibco公司；兔源心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）多克隆抗                       纤维细胞增殖，培养48 h后，弃去上清液，细胞用不含血
        体（批号：BM1765）、SABC-FITC标记山羊抗兔IgG二抗                   清的 DMEM 高糖培养基同步培养 24 h；弃去上清液，用
        （批号：SA1064）均购自武汉博士德生物工程有限公司；                        PBS清洗3遍，置于4％多聚甲醛溶液中固定10 min，加入
        0.4％台盼蓝染色液（华美生物工程有限公司，批号：                           cTnⅠ多克隆抗体（稀释度为1∶50），4 ℃孵育过夜；加入
        C0040）；ATP 检 测 试 剂 盒（瑞 士 Roche 公 司 ，批 号 ：           SABC-FITC 标记山羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 1 ∶ 100），


        ·150  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2                                   中国药房    2020年第31卷第2期
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