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2.3.2 体外3D细胞模型评价EG遗传毒性 2.4 大鼠体内实验评价EG遗传毒性
[8]
参考卢贤欢等 的 3D 悬滴细胞模型培养方法构建 2.4.1 大鼠分组及给药
体外 3D HepaRG 细胞模型，将 HepaRG 经 2％DMSO 高 30 只大鼠分为空白对照组（0.5％羧甲基纤维素钠
TM
密度诱导培养 14 d 后，接种于 GravityPlus 板以悬滴法 溶液）、甲磺酸乙酯组（阳性对照，200 mg/kg，给药剂量参
[14]
培养 4 d；待形成肝细胞微球后加入培养液并将其转移 考文献 ，给药时用0.5％羧甲基纤维素钠溶液制备灌胃
溶液，甲磺酸乙酯为检测体内 DNA 断裂或染色体损伤
至 Gravity TRAPTM 板中；隔天换液，连续培养 10 d，即
时最常用阳性对照，故体内研究选择甲磺酸乙酯作为阳
得 3D HepaRG 细胞模型；然后分为空白对照组（0.5％
性对照）和 EG 低、中、高剂量组（100、300、1 000 mg/kg，
DMSO）、丝裂霉素 C 组（阳性对照，6 µg/mL）和 EG 低、
[15]
给药剂量参考文献 ，给药时用0.5％羧甲基纤维素钠溶
中、高剂量组（10、50、200 µg/mL），连续给药 3 次，每次
液制备灌胃溶液），每组6只。连续灌胃给药15 d，每天1
48 h，最后 1 次给药时加入含细胞松弛素 B（6 µg/mL）的
次，给药体积为 15 mL/kg，末次给药 3 h 后所有大鼠以
培养基。然后收集各组细胞，按“2.3.1”项下方法进行微
CO2吸入法麻醉，从腹腔后大静脉取血用于彗星试验，采
核试验与碱性彗星试验。
血量约0.5 mL/只。
结果，与空白对照组比较，丝裂霉素C组HepaRG细 2.4.2 微核试验
胞的微核形成率和尾 DNA 百分含量均显著升高（P＜ （1）骨髓微核试验。将大鼠处死后，取其单侧股骨，
0.01 或 P＜0.001），EG 高剂量组 HepaRG 细胞的尾 DNA 剪断两端开放骨髓腔；吸取胎牛血清约1～2 mL，使用注
百分含量显著升高（P＜0.01），且随着 EG 剂量的增加， 射器针头冲洗骨髓至试管中，并反复抽吸针头数次吹打
3D HepaRG 细胞的尾 DNA 百分含量升高，存在剂量效 制成骨髓细胞悬液，经1 000 r/min离心5 min后，弃去大
应相关性；EG 各剂量在 3D HepaRG 细胞模型微核试验 部分上清液，将骨髓细胞沉淀吹打均匀；吸取适量骨髓
结果虽为阴性，但微核形成率随给药剂量增加有升高趋 细胞悬液滴于洁净玻片上推片，标本置于室温下干燥，
[14]
势。体外3D HepaRG细胞模型的微核形成率及尾DNA 再经甲醇固定 15 min 后晾干待检 。每只大鼠骨髓细
百分含量测定结果见图2。 胞样本计数 200 个总红细胞中的嗜多染红细胞的数目，
以及 2 000 个嗜多染红细胞中含微核细胞的数目，分别
25 ＊＊
计算嗜多染红细胞占总红细胞的百分率以及嗜多染红
20
％ 15 细胞的微核形成率。
微核形成率， 10 织，用刀片切成 2～3 mm 小块，加入含 0.05％胶原酶的
（2）肝脏微核试验。取大鼠肝左叶约 5 mm 大小组
3
3
5 HBSS溶液，于37 ℃水浴中振摇孵育1 h，每30 min人工

0 用力振摇1次，再用移液器反复吹打消化后的细胞悬液
EG高剂量组
空白对照组 EG中剂量组 丝裂霉素C组 50 次，再经 40 μm 细胞筛过滤后，加入 3 mL 固定液（无
EG低剂量组
A. 微核形成率 水甲醇 ∶ 冰醋酸＝3 ∶ 1，V/V）固定，并以 800 r/min 离心 1
30 min；弃上清，再次加入3 mL固定液并重悬，样本于4 ℃
＊＊＊ 条件保存待检。镜检前，取10～20 μL细胞悬液，加入等
％ 20 体积的吖啶橙-DAPI 溶液进行荧光染色；染色后，取
尾DNA百分含量， 10 ＊＊ 10～20 μL 混合液滴片后加盖玻片，于荧光显微镜下观

察。每只大鼠的样本计数 1 000 个含微核的肝细胞，计
算肝细胞微核率。
结果，与空白对照组比较，甲磺酸乙酯组大鼠骨髓
0
EG低剂量组
EG高剂量组
空白对照组 EG中剂量组 丝裂霉素C组 嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率均显著升高（P＜
B. 尾DNA百分含量 0.01），EG各剂量组大鼠骨髓嗜多染红细胞/总红细胞比
例和嗜多染红细胞、肝细胞的微核形成率差异无统计学
＊＊
注：与空白对照组比较， P＜0.01， ＊＊＊ P＜0.001
Note：vs. blank control group， P＜0.01， ＊＊＊ P＜0.001 意义（P＞0.05），但随着 EG 剂量的增加，嗜多染红细胞
＊＊
图 2 体外 3D HepaRG 细胞试验中微核形成率及尾 微核形成率及肝细胞微核形成率均有所增加，存在剂量
DNA百分含量测定结果（n＝3） 效应相关性。各组大鼠骨髓嗜多染红细胞/总红细胞比
Fig 2 Micronucleus formation rate and tail DNA％％ of 例和嗜多染红细胞、肝细胞微核形成率的测定结果见
in vitro 3D HepaRG cell test（n＝3） 表1。

中国药房 2020年第31卷第1期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 1 ·21 ·