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动 蛋 白（β-actin）抗 体（美 国 Proteintech 公 司 ，批 号 ：        后 30 min，均观察其一般行为学症状及舌质情况，以判
        60008-1-Ig）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白质浓度测定试剂                     定模型是否建立成功。
        盒、电化学发光（ECL）显色试剂盒、RIPA裂解液（上海生                       2.4 血压测定
        工生物工程股份有限公司，批号：170818、CS06668-                          末次给药后30 min，分别采用尾动脉搏动法测定各
        0050、A610425- 0005）；其他试剂均为分析纯。                      组大鼠血压（1 mmHg≈133.322 Pa）。
        1.3 动物                                              2.5 脑组织中5-HT、CGRP含量测定
            SHR 大鼠 50 只、SD 大鼠 10 只，♂，SPF 级，体质量                   血压测定后，将大鼠处死，解剖取其脑组织，以 1 g
        220～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实                       脑组织加入 2 mL 生理盐水的比例进行匀浆，然后以
        验动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，实验动物                     3 000 r/min离心10 min，取上清液，参照ELISA试剂盒说
        使用许可证号：SYXK（湘）2014-0012。大鼠购入后饲养                     明书操作检测脑组织匀浆中5-HT、CGRP含量。
        在新药药效与安全性评价湖南省重点实验室中的 SPF                           2.6 脑组织中CGRP蛋白表达测定
        级动物实验室内，所有动物实验研究均符合中国伦理委                                采用 Western blot 法检测脑组织 CGRP 蛋白表达。
        员会有关动物研究指导原则。实验期间环境温度为                              取各组大鼠脑组织 50 µg，9 g/L 氯化钠溶液冲洗后加入
        20～26 ℃，相对湿度为40％～70％。                               10 µL细胞裂解液，冰上裂解1 h，在4 ℃下以12 000 r/min
        2 方法                                                离心 10 min，取上清，采用 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒
        2.1 芎麻汤提取物的制备                                       测定蛋白浓度。取组织提取液行十二烷基硫酸钠-聚丙
            取川芎 200 g、天麻 50 g，加水 1 000 mL 浸泡 2 h，煎          烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，然后在 100 V 、4 ℃转移
        煮 2 次，每次煎煮保持微沸 30 min，合并滤液，水浴浓缩                     2 h至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；以含5％脱脂奶粉、聚山
        得到140 g浸膏，得率为56％。                                   梨酯20的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBST缓冲液）室温孵育
        2.2  造模与分组                                          2 h，加入封闭液稀释的一抗（1 ∶ 200），室温孵育 2 h，
            将50只SHR大鼠按血压随机分为5组，分别为模型                        0.1％ Triton-PBS 溶液洗膜 3 次，10 min/次；加入封闭液
        对照组、正天丸阳性对照组（1.6 g/kg，根据成人临床剂量                      稀释的二抗（1 ∶ 2 000），室温孵育 1 h，0.1％ Triton-PBS
        换算而得的等效剂量）和芎麻汤提取物低、中、高剂量组                           洗膜 3 次，10 min/次；参照试剂盒说明书进行 ECL 检测
        （4.5、9.0、18.0 g/kg，以生药量计，分别根据临床用量换算                 液显色、X光胶片显影定影，并采用Image J 2x软件检测
        而得的等效剂量的1、2、4倍剂量）；另取10只SD大鼠作                        条带灰度值，CGRP 蛋白的相对表达强度＝CGRP 条带
        为正常对照组。各给药组大鼠分别灌胃相应药物，正常                            灰度值/内参β-actin条带灰度值。
        对照组和模型对照组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天给                            2.7  统计学方法
        药1次，连续给药4周（28 d）。实验第29天，除正常对照                           采用SPSS 18.0统计学分析软件进行数据分析。计
                                                  [20]
                                       [19]
        组外，其余各组大鼠均参照 Pei P 等 、朱玉璞等 报道                       量资料采用 x±s 表示，若资料符合正态分布且方差齐
        的方法造模：以 2％戊巴比妥钠（2.0 mL/kg）腹腔注射麻                     时，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比
        醉后将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，剃除两眼到两                            较采用t检验；若资料呈非正态分布或（和）方差不齐时，
        耳之间的毛发，用碘酒消毒，逐层切开皮肤、肌肉，暴露                           先进行变量变换后再采用单因素方差分析和t检验进行
        颅骨。在前囟点后 3.2 mm，旁开 2.8 mm 处（右边）用牙                   比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        科钻插孔，将刺激电极插入三叉神经节，深度为硬脑下                            3 结果
        9.3～9.5 mm，术后持续麻醉。电极刺激参数为周期200                      3.1  芎麻汤提取物对大鼠一般行为学的影响
        ms、波宽5 ms、幅度10 V，连续刺激10 min。待大鼠清醒                       电刺激时大鼠均出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增多
        后，各组大鼠再次灌胃对应药物。                                     的症状。大鼠清醒后，与正常对照组比较，模型对照大
            模型成功评价标准：以大鼠双眼结膜颜色加深变                           鼠均出现双眼结膜颜色加深变红，易激惹，频繁打斗，提
        红，易激惹，频繁打斗，提尾时尖叫、惊跳甚至咬人等行                           尾时尖叫、惊跳甚至咬人，节律性抖动头部、过度理毛、
        为学变化及血压升高，为肝阳上亢证建立成功的观察标                            甩头、扭头等行为学表现，并且多数大鼠舌质紫暗，少数
        准 [17，21] ；以电刺激大鼠时出现咀嚼肌收缩、口鼻分泌物增                    大鼠有明显瘀斑或瘀点，这提示肝阳上亢兼瘀血型偏头
        多的症状，清醒后大鼠节律性抖动头部、过度理毛、甩头、                          痛模型建立成功。给药后，正天丸阳性对照组和芎麻汤
        扭头等行为学表现         [19-20] 及舌质紫暗，或有瘀斑、瘀点 为            提取物各剂量组大鼠以上症状均明显好转，个别大鼠以
                                                    [22]
        瘀血型偏头痛建立成功的观察标准。                                    上症状甚至完全消失。
        2.3  一般情况观察                                         3.2 芎麻汤提取物对模型大鼠收缩压的影响
            电刺激时，观察大鼠是否出现咀嚼肌收缩、口鼻分                              首次给药前：与正常对照组比较，模型对照组大鼠
        泌物增多的症状；电刺激结束待大鼠清醒后及末次给药                            收缩压显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，正天丸


        ·26  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 1                                    中国药房    2020年第31卷第1期
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