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SPF级SD大鼠30只，5～6周龄，均为♂。购于北京 5％ Giemsa应用液中，染色25～30 min之后置于超纯水
维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号： 中冲洗干净，室温下自然干燥。显微镜下观察并计数每
SCXK（京）2016-0006。 在 恒 温（20～26 ℃）、恒 湿 张玻片标本中每 500 个双核细胞中含微核的细胞数，计
（40％～70％）、各12 h明暗周期的条件下饲养。饲养密 算微核形成率，微核形成率＝（含微核双核细胞数/观察
度为2～3只/笼。提供经钴60放射灭菌的鼠全价颗粒饲 双核细胞总数）×100％ 。
[13]
料，自由摄食及饮水，取材前不禁食禁水。本研究方案 （2）碱性彗星试验。HepaRG 细胞处理及给药方法
通过国家药物安全评价监测中心实验动物福利伦理委
同“2.3.1（1）”项下微核试验，收获细胞后调整细胞浓度
员 会（Institutional animal care and use committee，IA-
5
为 2×10 mL ，将收获的细胞进行制片、裂解、解旋、电
－1
CUC）审查。
泳、中和、脱水等处理后制成单细胞凝胶标本，每组制备
2 方法与结果
3 张标本。所有标本使用 SYBR Green I（1 ∶ 10 000）染
2.1 给药浓度确定
色，并在荧光显微镜下拍照（放大倍数200～400）。再使
在96孔培养板中，每孔接种5 000个HepaRG细胞，
用 Komet 6.0 彗星图像分析软件进行分析，每个标本至
孵育 18～24 h 后给药。分别设置空白对照组（0.5％
少分析 100 个彗星细胞的尾 DNA 百分含量并计算中
DMSO）和EG给药组（给药浓度分别为324、162、81、27、
位数。
9、3 µg/mL），于 37 ℃，5％CO2的条件下孵育 24 h 后，即
结果，与空白对照组比较，丝裂霉素C组HepaRG细
得2D HepaRG细胞模型，然后每孔加入等体积的三磷酸
胞的微核形成率和尾 DNA 百分含量均显著升高（P＜
腺苷检测试剂，轻轻晃动，室温平衡10 min后，采用酶标
仪检测各孔的三磷酸腺苷发光强度，并计算细胞存活率 0.01），且其微核形成率和尾 DNA 百分含量在文献报道
[13]
（％）＝（EG 各给药组发光强度/空白对照组发光强度）× 的范围内 ，也表明体外 2D HepaRG 细胞模型构建成
100％，再根据浓度与存活率关系曲线计算 EG 的 IC50。 功；EG 各剂量组 HepaRG 细胞的微核形成率和尾 DNA
结果，2D HepaRG细胞模型中EG的IC50为205.4 µg/mL， 百分含量差异无统计学意义（P＞0.05）。体外2D Hepa-
因此，将后续体外 2D HepaRG 细胞模型评价试验中的 RG 细胞模型的微核形成率及尾 DNA 百分含量测定结
EG高浓度设置为200 µg/mL，由于体外3D HepaRG细胞 果见图1。
模型评价试验中的给药时间长，给药浓度不应高于体外 25
2D HepaRG 细胞模型评价试验，为保证 EG 在不同体外 20
细胞模型中的可比性，本研究 EG 在 2D、3D HepaRG 细 ％ 15
胞模型中给药浓度保持一致。 微核形成率， ＊＊
2.2 统计学方法 10
微核试验、碱性彗星试验结果以平均值±标准差 5
（x±s）的形式列出。彗星试验结果采用单因素方差分 0
EG低剂量组
EG高剂量组
析对组间数据进行检验；微核试验结果采用 Poisson 分 空白对照组 EG中剂量组 丝裂霉素C组
布法检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。数据图与 A. 微核形成率
统计结果经GraphPad Prism 7软件处理生成。 25
＊＊
2.3 体外细胞试验评价EG遗传毒性 ％ 20
2.3.1 体外2D HepaRG细胞模型评价EG遗传毒性 15
（1）微核试验。调整 HepaRG 细胞浓度为 5×10 5 尾DNA百分含量， 10
mL ，取6孔细胞培养板，每孔添加2 mL培养液/细胞混 5
－1
合液，置37 ℃、5％CO2孵箱培养18～24 h。细胞达对数
0
EG高剂量组
EG低剂量组
生长期时，将其分为空白对照组（0.5％DMSO）、丝裂霉 空白对照组 EG中剂量组 丝裂霉素C组
素 C 组（阳性对照，0.1 µg/mL）及 EG 低、中、高剂量组
B. 尾DNA百分含量
（10、50、200 µg/mL），处理 24 h 后更换含细胞松弛素 B
＊＊
注：与空白对照组比较， P＜0.01
（2 µg/mL）的培养基，继续培养 40 h。收获细胞并加入 Note：vs. blank control group， P＜0.01
＊＊
0.075 mol/L的氯化钾溶液2 mL，室温低渗处理5 min；加 图 1 体外 2D HepaRG 细胞试验中微核形成率及尾
入固定液（无水甲醇 ∶ 无水乙酸＝3 ∶ 1，V/V）5 mL 固定， DNA百分含量测定结果（n＝3）
1 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复固定2次，每个样 Fig 1 Micronucleus formation rate and tail DNA％％ of
品滴片制备 2 张标本并编号。固定后的玻片标本浸入 in vitro 2D HepaRG cell test（n＝3）
·20 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 1 中国药房 2020年第31卷第1期
