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表 1 各组大鼠骨髓嗜多染红细胞/总红细胞比例和嗜 系的可靠性。本研究根据文献及经验在体内及体外研
多染红细胞、肝细胞微核形成率的测定结果（x±± 究中选择不同阳性对照，证实试验体系成立、评价结果
s，n＝6） 可信。丝裂霉素C为体外微核试验常用阳性对照药，可
[13]
Tab 1 Proportion and micronucleus formation rate of 在非代谢活化条件下诱导微核试验呈阳性结果 。鉴
bone marrow polychromatic erythrocytes and 于当前针对体外彗星试验，尤其是 3D 模型彗星试验的
hepatocytes in rats of each group（x±±s，n＝6） 文献报道较少，且微核试验所用阳性对照药及浓度范围
嗜多染红细胞/ 嗜多染红细胞微 肝细胞微核 通常可兼顾彗星试验，故使用丝裂霉素C同时作为体外
组别 剂量
总红细胞 核形成率，％ 形成率，％ 微核和彗星试验的阳性对照药 。甲磺酸乙酯是以体
[16]
空白对照组 0.5％羧甲基纤维素钠 0.54±0.02 0.20±0.10 0.16±0.13
EG低剂量组 100 mg/kg 0.59±0.06 0.36±0.27 0.20±0.12 内染色体和 DNA 损伤为检测终点时常用的阳性对照
EG中剂量组 300 mg/kg 0.57±0.03 0.58±0.19 0.38±0.10 药，同时也是体内彗星试验联合验证的指定阳性对照 ，
[17]
EG高剂量组 1 000 mg/kg 0.53±0.04 0.78±0.30 0.54±0.09 故本研究将其作为体内微核和彗星试验的阳性对照。
甲磺酸乙酯组 200 mg/kg 0.47±0.04 2.10±0.38 ＊＊ 1.32±0.38 ＊＊
研究EG的致癌性风险对于临床安全用药具有重要
注：与空白对照组比较， P＜0.01
＊＊
指导意义。本研究首次同时利用体外 2D、3D 细胞模型
Note：vs. blank control group， P＜0.01
＊＊
2.4.3 碱性彗星试验 及大鼠连续15 d体内重复给药试验评价EG的遗传毒性
采集大鼠外周血约50 μL备用。肝组织样本采集肝 风险。体内研究在传统骨髓微核试验的基础上增加肝
左叶约 2～3 mm 大小组织置于 3 mL 切碎液（含 20 微核试验，并平行取外周血及肝组织开展彗星试验。肝
3
mmol/L EDTA-2Na 和 10％ DMSO 的 Hanks 平衡溶液） 微核试验可同时考察毒性靶组织及药物代谢产物的遗
中并使用剪刀剪碎组织以释放细胞，经40 μm细胞筛过 传毒性，尤其在代谢产物体内遗传毒性评价方面具有独
[18]
滤后置于冰上备用。取外周血淋巴细胞和肝细胞参考 特优势 。
“2.3.1（2）”和“2.3.2”项下方法，分别进行体外 2D、3D 细 本研究发现，在体外3D HepaRG细胞模型中，EG高
胞模型的碱性彗星试验，测尾DNA百分含量和尾距（尾 剂量组 HepaRG 细胞的尾 DNA 百分含量与空白对照组
距＝尾 DNA 百分含量×头部中心至尾部中心的距离）。 相比显著升高，且尾DNA百分含量与EG浓度存在明显
结果，与空白对照组比较，甲磺酸乙酯组大鼠外周血淋 的剂量效应相关性；微核试验结果虽为阴性，但可见类
巴细胞、肝细胞的尾 DNA 百分含量、尾距均显著升高 似趋势。体内研究中，尽管 EG 在传统骨髓嗜多染红细
（P＜0.01），EG高剂量组大鼠外周血淋巴细胞尾DNA百 胞微核试验中呈阴性，但各剂量组微核形成率随剂量升
分含量显著升高（P＜0.01），EG 各剂量组大鼠肝细胞的 高有一定升高趋势，且与肝微核试验结果基本相符；此
微核形成率和肝细胞尾 DNA 百分含量、尾距差异无统 外，EG 高剂量组可导致外周血淋巴细胞 DNA 明显损
计学意义（P＞0.05），由此可知，EG 对外周血淋巴细胞 伤，各剂量组之间呈剂量效应相关性，肝细胞彗星试验
的染色体或DNA损伤效应强于肝细胞。各组大鼠外周 结果为阴性但可见类似趋势。2项研究中外周血淋巴细
血淋巴细胞、肝细胞尾 DNA 百分含量及尾距的测定结 胞均较肝细胞更为敏感，可见 EG 可与外周血淋巴细胞
果见表2。 DNA相互作用，存在一定遗传毒性风险。相关体外和体
表2 各组大鼠外周血淋巴细胞、肝细胞尾DNA 百分含 内研究报道，含蒽醌环的化合物可导致遗传物质断裂、
量及尾距的测定结果（x±±s，n＝6） 并导致微核试验和彗星试验结果呈阳性，如大黄素可诱
[19]
Tab 2 Tail DNA％％ and tail distance of peripheral 导小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成率升高 ，可导致体
blood lymphocytes and hepatocytes in rats of 外培养人淋巴母细胞和肝细胞DNA断裂 [4，20] 。大黄素和
[20]
each group（x±±s，n＝6） 大黄酸可诱导哺乳动物细胞tk基因突变率增加 ，芦荟
外周血淋巴细胞 肝细胞 大黄素在排泄过程中可导致肾细胞和结肠细胞的DNA
组别 剂量 尾DNA百分 尾DNA百分 断裂等 。分析原因认为与蒽醌结构可与 Topo Ⅱ
[21]
含量，％ 尾距 含量，％ 尾距
空白对照组 0.5％羧甲基纤维素钠 1.19±0.30 0.14±0.03 2.23±0.48 0.21±0.03 （Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ）的三磷酸腺苷结构域竞争
EG低剂量组 100 mg/kg 0.96±0.27 0.11±0.03 5.05±1.85 0.57±0.29 结合并抑制 Topo Ⅱ的活性，从而导致该复合物不易解
EG中剂量组 300 mg/kg 2.50±0.37 0.29±0.17 5.77±0.88 0.60±0.10 离及DNA链断裂 [19] 。此外，也有研究显示，蒽醌类化合
EG高剂量组 1 000 mg/kg 4.71±1.27 ＊＊ 0.54±0.20 6.82±1.62 0.78±0.15
甲磺酸乙酯组 200 mg/kg 20.00±3.36 ＊＊＊ 4.19±1.25 ＊＊＊ 16.13±5.52 ＊＊＊ 3.90±1.85 ＊＊＊ 物经Ⅰ相代谢后其遗传毒性更强，如在体外试验中添
注：与空白对照组比较， P＜0.01， ＊＊＊ P＜0.001 加大鼠肝微粒体酶 S9 后（S9 混合物配方中仅含启动Ⅰ
＊＊
Note：vs. blank control group， P＜0.01， ＊＊＊ P＜0.001 相代谢反应的底物），其中芦荟大黄素可诱导更多回复
＊＊
3 讨论 性菌落形成 。有研究根据大鼠灌胃EG后，在血浆、尿
[15]
遗传毒性试验通常平行设置阳性对照，确保试验体 和粪便样本中均可检测到大黄素，推测 EG 在体内先水

·22 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 1 中国药房 2020年第31卷第1期